Фактор Ха инхибитори (фондапаринукс, ривароксабан, апиксабан)

1. Механизъм на действие: фондапаринукс е синтетичен пентасахарид, който се свързва с антитромбин; ривароксабан, апиксабан и едоксабан (не са регистрирани в Руската федерация) - инхибират фактор Xa без участието на антитромбин.

2. Не се изисква мониторинг на антикоагулантния ефект. След 2-4 часа след приемане на ривароксабан (приемането на апиксабан дава по-слаб ефект), при повечето пациенти се наблюдава повишаване на протромбиновото време (с автоматично изчисляване на INR може да бъде> 2), както и APTT (обикновено до 50 сек.); тромбиновото време остава в нормалните граници (за разлика от дабигатран). Ако е необходимо да се извърши спешна операция с висок риск от кървене, трябва да се определи протромбиновото време (удължаването над референтните стойности показва продължителен антикоагулационен ефект). Ефектът на ривароксабан и апиксабан може да се оцени чрез определяне на активността на анти-Ха с подходящи калибратори (без екзогенен антитромбин).

3. Противопоказания: същите като за хепарин (с изключение на HIT), както и бременност и кърмене. Дабигатран е противопоказан при бъбречна недостатъчност с 80-годишен креатининов клирънс, приемащ амиодарон или верапамил, а в някои случаи при пациенти с намалена бъбречна функция (GFR 30-50 ml / min). Едновременното приложение на дабигатран и други антикоагуланти (с изключение на UFH в дози, използвани за промиване на централните катетри), антитромбоцитни средства, тромболитици или декстрани може да повиши риска от кървене.

При пациенти с креатининов клирънс 15-49 ml / min или висок риск от кървене (особено от стомашно-чревния тракт), дозата на ривароксабан трябва да се намали. Дозата на апиксабан трябва да бъде намалена, ако са налице 2 от 3 критерия: възраст> 80 години, тегло ≤ 60 kg и ниво на креатинина> 133 μmol / l. Намалете дозата на едоксабан при хора с креатининов клирънс от 15-50 ml / min, както и при хора с телесно тегло ≤60 kg.

4. Принципи на отнемане на лекарството преди операция → маса. 2.34-2. Ако е необходима спешна операция при пациенти, приемащи ривароксабан или апиксабан, помислете за използването на концентрат от фактори на протромбиновия комплекс (PDA). Ако е необходимо да се преустанови инхибитор на фактор Ха преди операция, не използвайте преходна терапия с хепарин, с изключение на пациенти с висок тромботичен риск (→ табл. 2.34-8). Приемането на тези лекарства може да бъде възобновено след 6-8 часа след операцията, свързано с нисък риск от хеморагични усложнения, а при висок риск от хеморагични усложнения - след 48-72 часа.,

Антикоагуланти: основни лекарства

Усложнения, причинени от тромбоза на кръвоносните съдове - основната причина за смърт при сърдечно-съдови заболявания. Ето защо, в съвременната кардиология, голямо значение се придава на превенцията на тромбозата и емболията (оклузия) на кръвоносните съдове. Коагулацията на кръвта в най-простата форма може да бъде представена като взаимодействие на две системи: тромбоцити (клетки, отговорни за образуването на кръвен съсирек) и протеини, разтворени в кръвната плазма - коагулационни фактори, под действието на които се образува фибрин. Полученият тромб се състои от конгломерат от тромбоцити, заплетен в нишки от фибрин.

Две групи лекарства се използват за предотвратяване на образуването на кръвни съсиреци: антиагреганти и антикоагуланти. Антитромбоцитните средства инхибират образуването на тромбоцитни тромбоцити. Антикоагулантите блокират ензимните реакции, водещи до образуването на фибрин.

В нашата статия ще разгледаме основните групи антикоагуланти, индикации и противопоказания за тяхното използване, странични ефекти.

класификация

В зависимост от точката на приложение се разграничават антикоагулантите на пряко и непряко действие. Директните антикоагуланти инхибират синтеза на тромбин, инхибират образуването на фибрин от фибриногена в кръвта. Косвени антикоагуланти инхибират образуването на фактори на кръвосъсирването в черния дроб.

Директни коагуланти: хепарин и неговите производни, директни тромбинови инхибитори, както и селективни инхибитори на фактор Ха (един от факторите на кръвосъсирването). Косвени антикоагуланти включват антагонисти на витамин К.

  1. Антагонисти на витамин К:
    • Фенидин (фенилин);
    • Варфарин (warfarex);
    • Аценокумарол (syncumar).
  2. Хепарин и неговите производни:
    • хепарин;
    • Антитромбин III;
    • Dalteparin (fragmin);
    • Еноксапарин (анфибра, хемапаксан, клексан, еникс);
    • Nadroparin (фраксипарин);
    • Парнапарин (Fluxum);
    • Сулодексид (Angioflux, Wessel Due f);
    • Бемипарин (Cybor).
  3. Директни тромбинови инхибитори:
    • Бивалирудин (angiox);
    • Дабигатран етексилат (Pradax).
  4. Селективни инхибитори на фактор Ха:
    • Апиксабан (Eliquis);
    • Фондапаринукс (ариктра);
    • Rivaroxaban (xarelto).

Витамин К антагонисти

Косвени антикоагуланти са основа за предотвратяване на тромботични усложнения. Тяхната таблетна форма може да се приема за дълго време амбулаторно. Доказано е, че използването на непреки антикоагуланти намалява честотата на тромбоемболичните усложнения (инфаркт, инсулт) при предсърдно мъждене и наличието на изкуствена сърдечна клапа.

Fenilin понастоящем не се използва поради високия риск от нежелани ефекти. Sincumar има дълъг период на действие и се натрупва в организма, така че се използва рядко поради трудността да се контролира терапията. Най-често използваното лекарство от групата на антагонистите на витамин К е варфарин.

Варфаринът се различава от другите непреки антикоагуланти с ранния си ефект (10–12 часа след поглъщане) и от бързото преустановяване на нежеланите ефекти при по-ниски дози или оттегляне на лекарството.

Механизмът на действие е свързан с антагонизма на това лекарство и витамин К. Витамин К участва в синтеза на определени фактори на кръвосъсирването. Под въздействието на варфарин този процес е нарушен.

Варфарин се предписва за предотвратяване на образуването и растежа на венозни кръвни съсиреци. Използва се за продължителна терапия за предсърдно мъждене и при наличие на интракардиален тромб. При тези състояния рискът от инфаркти и инсулти, свързани с блокиране на кръвоносните съдове с отделни съсиреци, е значително увеличен. Употребата на варфарин помага за предотвратяване на тези сериозни усложнения. Това лекарство често се използва след инфаркт на миокарда, за да се предотврати повторна коронарна катастрофа.

След протезиране на сърдечните клапи, приемането на варфарин е необходимо поне няколко години след операцията. Той е единственият антикоагулант, използван за предотвратяване образуването на кръвни съсиреци на изкуствени сърдечни клапи. Постоянното приемане на това лекарство е необходимо за някои тромбофилии, по-специално за антифосфолипиден синдром.

Варфарин се предписва за разширени и хипертрофични кардиомиопатии. Тези заболявания са придружени от разширяване на кухините на сърцето и / или хипертрофия на стените му, което създава предпоставки за образуването на интракардиални тромби.

При лечение с варфарин е необходимо да се оцени неговата ефикасност и безопасност чрез мониторинг на INR - международното нормализирано съотношение. Този показател се оценява на всеки 4 - 8 седмици от приема. На фона на лечението INR трябва да бъде 2,0 - 3,0. Поддържането на нормална стойност на този показател е много важно за предотвратяване на кървене, от една страна, и засилване на съсирването на кръвта, от друга.

Някои храни и билки увеличават ефекта на варфарин и увеличават риска от кървене. Това са боровинки, грейпфрут, чесън, корен от джинджифил, ананас, куркума и др. Отслабва антикоагулантния ефект на лекарственото вещество, съдържащо се в листата на зелето, брюкселско зеле, китайско зеле, цвекло, магданоз, спанак, маруля. Пациентите, приемащи варфарин, не могат да се откажат от тези продукти, но да ги приемате редовно в малки количества, за да предотвратите внезапни колебания на лекарството в кръвта.

Страничните ефекти включват кървене, анемия, локална тромбоза, хематом. Активността на нервната система може да бъде нарушена с развитието на умора, главоболие, вкусови нарушения. Понякога има гадене и повръщане, коремна болка, диария, нарушена чернодробна функция. В някои случаи кожата е засегната, появява се пурпурна боя на пръстите, парестезии, васкулит и студенината на крайниците. Може да се развие алергична реакция под формата на сърбеж, уртикария, ангиоедем.

Варфарин е противопоказан по време на бременност. Не трябва да се предписва за всякакви състояния, свързани със заплахата от кървене (травма, операция, язви на вътрешните органи и кожата). Не го използвайте за аневризми, перикардит, инфекциозен ендокардит, тежка хипертония. Противопоказание е невъзможността за адекватен лабораторен контрол поради недостъпност на лабораторията или личностните характеристики на пациента (алкохолизъм, липса на организация, сенилна психоза и др.).

хепарин

Един от основните фактори за предотвратяване на съсирването на кръвта е антитромбин III. Нефракционираният хепарин се свързва с него в кръвта и увеличава активността на молекулите му няколко пъти. В резултат на това реакциите, насочени към образуването на кръвни съсиреци в съдовете, са потиснати.

Хепарин се използва повече от 30 години. Преди това се прилага подкожно. Сега се смята, че нефракционираният хепарин трябва да се прилага интравенозно, което улеснява контрола върху безопасността и ефикасността на терапията. За подкожно приложение се препоръчват нискомолекулни хепарини, които ще разгледаме по-долу.

Хепаринът най-често се използва за предотвратяване на тромбоемболични усложнения при остър миокарден инфаркт, включително по време на тромболиза.

Лабораторният контрол включва определяне на времето за активиране на частичния тромбопластин. На фона на лечението с хепарин след 24-72 часа, то трябва да бъде 1,5–2 пъти повече от първоначалното. Необходимо е също да се контролира броят на тромбоцитите в кръвта, за да не се пропусне развитието на тромбоцитопения. Обикновено терапията с хепарин продължава от 3 до 5 дни с постепенно намаляване на дозата и по-нататъшно отменяне.

Хепаринът може да предизвика хеморагичен синдром (кървене) и тромбоцитопения (намаляване на броя на тромбоцитите в кръвта). При продължителна употреба в големи дози е вероятно развитие на алопеция (алопеция), остеопороза и хипоалдостеронизъм. В някои случаи се появяват алергични реакции, както и повишаване на нивото на аланин аминотрансферазата в кръвта.

Хепарин е противопоказан при хеморагичен синдром и тромбоцитопения, язва на стомаха и дванадесетопръстника, кървене от пикочните пътища, перикардит и остра сърдечна аневризма.

Хепарини с ниско молекулно тегло

Далтепарин, еноксапарин, надропарин, парнапарин, сулодексид, бемипарин се получават от нефракциониран хепарин. Те се различават от последните с по-малък размер на молекулата. Това повишава безопасността на лекарствата. Действието става по-дълго и по-предсказуемо, така че използването на нискомолекулни хепарини не изисква лабораторен контрол. Може да се извърши с помощта на фиксирани дози - спринцовки.

Предимството на нискомолекулните хепарини е тяхната ефективност, когато се прилагат подкожно. Освен това те имат значително по-малък риск от странични ефекти. Затова понастоящем хепариновите производни изместват хепарина от клиничната практика.

Хепарините с ниско молекулно тегло се използват за предотвратяване на тромбоемболични усложнения по време на хирургични операции и дълбока венозна тромбоза. Те се използват при пациенти, които са на легло и имат висок риск от такива усложнения. В допълнение, тези лекарства са широко предписани за нестабилна стенокардия и инфаркт на миокарда.

Противопоказанията и неблагоприятните ефекти на тази група са същите като при хепарина. Въпреки това, тежестта и честотата на страничните ефекти са много по-малко.

Директни тромбинови инхибитори

Директните тромбинови инхибитори, както подсказва името, директно инактивират тромбин. В същото време те инхибират активността на тромбоцитите. Употребата на тези лекарства не изисква лабораторен мониторинг.

Бивалирудин се прилага интравенозно при остър миокарден инфаркт за предотвратяване на тромбоемболични усложнения. В Русия, този наркотик все още не е използван.

Dabigatran (pradaksa) е таблетиран агент за намаляване на риска от тромбоза. За разлика от варфарин, той не взаимодейства с храната. Проучванията върху това лекарство продължават, с постоянна форма на предсърдно мъждене. Лекарството е одобрено за употреба в Русия.

Селективни инхибитори на фактор Ха

Фондапаринукс се свързва с антитромбин III. Такъв комплекс интензивно инактивира X фактора, намалявайки интензивността на тромбообразуването. Той е назначен подкожно при остър коронарен синдром и венозна тромбоза, включително белодробна емболия. Лекарството не причинява тромбоцитопения и не води до остеопороза. Не се изисква лабораторен контрол на неговата сигурност.

Фондапаринукс и бивалирудин са особено показани при пациенти с повишен риск от кървене. Чрез намаляване на честотата на кръвни съсиреци в тази група пациенти, тези лекарства значително подобряват прогнозата на заболяването.

Фондапаринукс се препоръчва за употреба при остър миокарден инфаркт. Не може да се използва само с ангиопластика, тъй като повишава риска от образуването на кръвни съсиреци в катетрите.

Клинични изпитвания на инхибитори на фактор Ха под формата на таблетки.

Най-честите нежелани реакции включват анемия, кървене, коремна болка, главоболие, сърбеж, повишена активност на трансаминазите.

Противопоказания - активно кървене, тежка бъбречна недостатъчност, непоносимост към компонентите на лекарството и инфекциозен ендокардит.

Xarelto: Монография Иновативен орален антикоагулант

РАЗДЕЛ 2
XARELTO®: ИНОВАТИВЕН УСТЕН АНТИКОАГУЛАНТ

резюме

  • Xarelto® е директно специфичен селективен инхибитор на Xa фактора, който действа като ключов фактор в коагулационната каскада.
  • Фактор Ха катализира превръщането на протромбин в тромбин. Xarelto® няма пряко действие върху тромбина, но регулира образуването на тромбин чрез инхибиращ фактор Ха.
  • За разлика от индиректните инхибитори на фактор Ха, Xarelto® директно инхибира както свободния, така и свързания с фибрин фактор Ха и протромбиназния комплекс.
  • Xarelto® има предсказуема фармакодинамика и фармакокинетика.
  • Xarelto ® има добър баланс между ползи и рискове в широк диапазон от дози.

Xarelto®: инхибитор на директен фактор Ха

Xarelto® (ривароксабан) е първият пряк инхибитор на Xa фактора. Той е един от представителите на новото поколение лекарства, предназначени да отговорят на клиничната необходимост от превенция на ВТЕ при възрастни пациенти, които са били подложени на планирана смяна на бедрото или коляното. Xarelto ® е разработен и за употреба при пациенти с висок риск от белодробна емболия. Xarelto ® се предписва веднъж дневно, по 1 таблетка от 10 mg, независимо от възрастта, пола, етническата принадлежност или телесното тегло, за възрастни пациенти, които преминават през планирана замяна на тазобедрена или коленна става. Регулирайте дозата не е необходимо. Предимството на лекарството е, че пациентите не трябва да бъдат обучавани сами за извършване на инжекции.

Фармакокинетичните и фармакодинамичните свойства на Xarelto® са предсказуеми, както е показано в проучвания, включващи здрави възрастни доброволци и възрастни пациенти, които са били подложени на планирана смяна на тазобедрената става или коляното 42. Xarelto® се абсорбира бързо, което осигурява бързо начало на действие. Максимална плазмена концентрация (Сите) се постига за 2-4 часа след перорално приложение. Абсолютната бионаличност на Xarelto®, когато се приема в доза от 10 mg е висока (80-100%) 43. Крайният полуживот е средно 7-11 часа.

Според резултатите от Фаза II проучвания за определяне на оптималната доза, за Xarelto ® е установено, че има широк терапевтичен коридор: има широк диапазон на дозата между началото на антикоагулантния ефект и развитието на кървене 44-46.

Не се изисква текущ контрол на съсирването и броя на тромбоцитите. В допълнение, Xarelto ® има благоприятен профил на взаимодействие (вж. Точка 5), може да се използва по време на хранене или на празен стомах 43.47.

Механизъм на действие Xarelto®

Xarelto ® е директно специфичен високоселективен инхибитор на Xa фактор, ензим, който действа като ключова точка в коагулационната каскада (Фиг. 2). В продължение на много години концепцията за кръвосъсирването се представя под формата на каскада с две ясни изходни точки: вътрешни и външни пътеки. Развитието на познанията за протеините и клетките, участващи в процеса на кръвосъсирването, доведе до създаването на клетъчен коагулационен модел, който се основава на разбирането на взаимодействието на клетъчната активност и коагулационните протеини и води до образуването на кръвен съсирек. В началната фаза тъканният фактор (TF), свързан с клетъчната мембрана, активира фактор VII, превръщайки го в UPA фактор, което води до образуването на TF - VIta комплекс. TF - ILA комплексът, свързан с клетъчната мембрана, активира фактори IX и X.

Фактор Ха преобразува малко количество протромбин (фактор II) в тромбин (фактор Na), който след това активира фактор V и VIII. В размножителната фаза се образува протромбиназен комплекс, състоящ се от фактор Va, фосфолипиди, калциеви йони и фактор Ха. Този комплекс превръща голямо количество протромбин в тромбин, който се нарича "експлозия на тромбин". Всяка молекула на фактор Ха произвежда приблизително 1000 молекули тромбин 50.

Както в модела на вътрешните / външните пътища на коагулационната каскада, така и в клетъчния модел на коагулацията, активирането на фактор X с превръщане в Ха играе водеща роля, тъй като това се случва още преди образуването на тромбин. Така, Xarelto® няма пряко действие върху тромбин, той регулира образуването му чрез блокиране на действието на фактор Ха и не блокира активността на тромбина.

Фиг. 2. Механизмът на кръвосъсирването. TF тъканен фактор

Единствените известни функции на фактор Ха са участието в процеса на коагулация и възпаление. Обратно, тромбинът притежава антикоагулантни и противовъзпалителни свойства, участва в фибринолизата (индиректно активира протеин С чрез системата на тромбин-тромбомодулин) в допълнение към прокоагулантната и провъзпалителната активност 34. Следователно, теоретично, нарушаването на тромбиновата функция с по-голяма степен на вероятност, отколкото инхибирането на фактор Ха, може да предизвика непредвидени плейотропни ефекти извън границите на коагулацията. 34

Тъй като една молекула на фактор Ха причинява образуването на приблизително 1000 молекули тромбин 50, инхибирането на фактор Ха теоретично осигурява по-мощен начин за контролиране на образуването на фибрин, отколкото инактивирането на тромбин. Инхибирането на фактор Ха намалява по-скоро образуването на тромбин, отколкото неговата каталитична активност, и следователно се очаква, че (инхибиране) няма да модулира регулаторните функции на тромбина при контролиране на хемостазата, включително клетъчна пролиферация и активиране на тромбоцитите 51.

Xarelto® инхибира както свободния, така и фиб-свързания фактор Ха, както и протромбиназния комплекс. Това е в контраст с непрякото инхибитор на фактор Ха, фондапаринукс, който потиска активността на фактор Ха чрез свързване с антитромбин и повишаване на неговото действие и не може да потиска асоциирания фактор Ха в протромбиновия комплекс. Дали такова действие на Xarelto® осигурява по-широко инхибиране на фактор Ха е въпрос, който изисква по-подробно изследване. Молекулата на Xarelto® е много по-малка по размер от комплекса на фондапаринук-антитромбин, което може да има клинични предимства, тъй като Xarelto® може да проникне в тромба по-ефективно от фондапаринукс, свързан с антитромбин 33.

Предсказуема фармакокинетика и фармакодинамика

Както е показано в проучвания, включващи здрави доброволци и пациенти, подложени на планирана протеза на коляното или тазобедрената става, Xarelto има предсказуем фармакокинетичен профил. Лекарството се абсорбира бързо след перорално приложение, Сите се достига за 2-4 часа 42. Абсолютната бионаличност е висока (80-100%) 43. Беше отбелязано време, пропорционално на дозата за постигане на плазмена концентрация с краен полуживот 7–11 часа средно в непроменена форма. Ключовите фармакокинетични характеристики на Xarelto® са показани в Таблица 3.

В допълнение, според проведеното изследване, Xarelto ® е установено, че:

  • не се натрупва при получаване на повторни дози от лекарството
  • може да се използва независимо от храненето, тъй като рН на стомаха не влияе на абсорбцията
  • минимално взаимодейства с други лекарства, когато се прилага едновременно, включително напроксен (500 mg), ацетилсалицилова киселина (500 mg), клопидогрел (300 mg натоварваща доза, последвана от поддържаща доза от 75 mg).
  • поддържа ефективност при екстремни телесни стойности 42,52,53
  • няма значима вариабилност във фармакокинетиката в зависимост от пола, възрастта и етническата принадлежност 42
  • показват по два начина
  • не образува значителни активни циркулиращи метаболити 54.

Таблица 3. Фармакокинетични характеристики на Xarelto®

Инфаркт на миокарда и нови перорални антикоагуланти: различават ли се инхибиторите на фактор II и фактор Ха?

Адекватната антитромботична и антикоагулантна терапия предотвратява развитието на тромбоза и съответно намалява риска от МИ. Резултатите от проучванията показват, че варфарин помага да се избегнат сърдечно-съдови усложнения при пациенти, които са претърпели миокарден инфаркт. 2–4 Защитният ефект на антикоагуланта се дължи на факта, че тромбоцитите и кръвосъсирващата система, върху които действа варфарин, играят роля в патогенезата на инфаркта на миокарда. 3

Новите орални антикоагуланти (PLA) елиминират много бариери, които ограничават употребата на антагонисти на витамин К. Въпреки това, лечението с перорални тромбинови инхибитори (фактор II) е придружено от повишаване на честотата на МИ в сравнение с варфарин. 5.6 В същото време, при пациенти, които са получавали други PLA, честотата на МИ е ниска и сравнима с тази при лечение с антагонисти на витамин К. 7,8 Съответно тези данни предизвикват противоречия относно това дали PLA се различава в влиянието на риска от развитие на MI.,

В статията се разглеждат резултатите от последните проучвания и се обсъждат механизмите на блокада на коагулационната каскада, които могат да допринесат за развитието на инфаркт на миокарда или, обратно, да намалят риска от неговото възникване.

Нови антикоагуланти: различни цели в каскадата на кръвосъсирването

Тромбинът е централен медиатор на процеса на кръвосъсирване, който служи като основна цел за директни орални инхибитори на тромбин, като дабигатран (фиг. 1).

Директните тромбинови инхибитори блокират превръщането на разтворимия фибриноген в фибрин и също така предотвратяват активирането на коагулационните фактори, които могат да доведат до допълнително образуване на тромбин и стабилизиране на кръвния съсирек. 9

Друг централен компонент на коагулационната каскада е превръщането на протромбин в тромбин под действието на активиран фактор X. Този етап се счита за привлекателна цел за антикоагулацията, като се има предвид по-ранното му място в коагулационната каскада в точката, където вътрешните и външните пътища се събират. 10,11 Инхибиторите на фактор Ха имат висока антикоагулантна активност, тъй като на този етап се наблюдава рязко увеличаване на кръвосъсирването - една молекула фактор Ха катализира образуването на около 1000 молекули тромбин. 12,13 Инхибирането на фактор Ха има силен ефект върху процеса на тромбоза, поради ефективното потискане на образуването на тромбин. 14

IM и директни тромбинови инхибитори

Възможността за увеличаване на честотата на ИМ при лечението на директни инхибитори на тромбин е отбелязана във фаза II и фаза III проучвания, в която се сравнява ефикасността и безопасността на дабигатран и антагонистите на витамин К. В някои от тези проучвания честотата на острия коронарен синдром не е била значително по-висока при пациенти, които са приемали дабигатран. 15,16,17

Едно такова проучване е RE-LY (рандомизирана оценка на антикоагулантната терапия), в която участват повече от 18 000 пациенти с предсърдно мъждене. 5.18

Дизайнът на проучването RE-LY не предполага сравнение между честотата на инфаркта на миокарда при лечението на дабигатран и варфарин. Въпреки това, годишната честота на MI (вторична крайна точка на проучването) в групата на дабигатран е по-висока, отколкото в групата пациенти, които приемат варфарин в дозата, избрана от INR. Годишната честота на ИМ е 0,53% в групата на варфарин, 0,72% в групата на дабигатран при доза 110 mg два пъти дневно (р = 0,07) и 0,74% в групата на дабигатран 150 mg два пъти дневно ( р = 0.048). 5

След завършването на RE-LY, изследователите проведоха ретроспективен анализ, който включва допълнителни сърдечносъдови резултати. 15.16 Въпреки че броят на случаите на миокарден инфаркт в групата на дабигатран е бил по-висок от този при лечението на антагонисти на витамин К, разликата между групите е загубила статистическа значимост. 15.16 Въпреки това споровете продължават и резултатите от някои мета-анализи показват увеличение на честотата на миокарден инфаркт при лечение с директни тромбинови инхибитори. 6

Мета-анализ

Противоречивите резултати от проучването RE-LY са основа за мета-анализ за сравняване на честотата на миокарден инфаркт при пациенти, които получават дабигатран или варфарин (фиг. 2). 6

Когато се комбинират данни от 7 рандомизирани контролирани проучвания при повече от 30 000 пациенти, отново е показано, че лечението с дабигатран е свързано с повишен риск от развитие на ИМ или остър коронарен синдром в сравнение с контролата. Годишната честота на ИМ е 1,19% в групата на дабигатран и 0,79% при пациенти, които получават варфарин, еноксапарин или плацебо (р = 0,03). Рискът остава повишен дори след включването в мета-анализа на ревизираните резултати от проучването RE-LY 14 и изключването на краткосрочни проучвания. Резултатите от втория мета-анализ, които оценяват риска от развитие на ИМ с лечение с орални директни инхибитори на тромбин или варфарин, потвърждават връзката между прякото инхибиране на тромбина и риска от МИ. Като цяло ползите от употребата на дабигатран надвишават рисковете, като се има предвид по-ниската честота на миокарден инфаркт в сравнение с инсулта.

Остри коронарни усложнения при лечение с ривароксабан

Инхибирането на фактор Ха не е съпътствано от увеличаване на честотата на миокарден инфаркт в сравнение с това при лечението на антагонисти на витамин К. В клинични проучвания при широк кръг пациенти, включително предсърдно мъждене (фиг. 3) и висок риск от венозни тромбоемболични усложнения, лечението с Xarelto® (ривароксабан) не повишава риска от развитие на миокарден инфаркт в сравнение с антагонистите на витамин К. 8

Припомняме също, че Xarelto (ривароксабан) е единствената PLA, която е регистрирала индикации за предотвратяване на смъртта поради сърдечносъдови причини и инфаркт на миокарда при пациенти след остър коронарен синдром (ACS), което е настъпило с увеличаване на кардиоспецифичните биомаркери в комбинирана терапия с ацетилсалицилова киселина. ) или с АСК и тиенопиридин (клопидогрел или тиклопидин).

Възможна причина?

Остава неясно защо инхибирането на фактор II е свързано с относително увеличение на честотата на миокарден инфаркт в сравнение с варфарин. 5,6 Този ефект може да се дължи на директно инхибиране на образуването на тромбин, тъй като той липсва при лечение с инхибитори на фактор Ха. В първоначалната публикация 5, изследователи на RE-LY предполагат, че дабигатран не притежава защитна активност срещу коронарни исхемични усложнения, което преди това е било показано при лечението с варфарин. Въпреки това, според авторите на мета-анализа, отбелязаният ефект е характерен за директните тромбинови инхибитори, тъй като подобни данни не са получени при лечението на инхибитори на фактор Ха. 6.8 Авторите предполагат, че преките инхибитори на тромбина имат нежелани свойства, които могат да повлияят на развитието на атеросклероза или резултати, свързани с атеросклеротично съдово заболяване. 6

литература

1. Kumar P, Clark M. Клинична медицина. 6 edn. Лондон: Elsevier Ltd.
2. Антикоагуланти в изследователската група за вторична превенция на коронарната тромбоза (ASPECT). Ефект от продължително перорално антикоагулантно лечение върху смъртността и сърдечно-съдовата заболеваемост след инфаркт на миокарда. Lancet 1994; 343: 499-503.
3. Hurlen M, Abdelnoor M, Smith P, Erikssen J, Arnesen H. Warfarin, аспирин, или и двете след инфаркт на миокарда. N Engl J Med 2002; 347: 969-974.
4. Rothberg MB, Celestin C, Fiore LD, Lawler E, Cook JR. Варфарин плюс аспирин след инфаркт на миокарда или остър коронарен синдром: мета-анализ с риск и полза. Arch Intern Med 2005; 143: 241-250.
5. Connolly SJ, Ezekowitz MD, Yusuf S, Eikelboom J, Oldgren J, Parekh A et al. Dabigatran срещу варфарин при пациенти с предсърдно мъждене. N Engl J Med 2009; 361: 1139-1151.
6. Учино К., Ернандес А.В. Рискови коронарни събития: мета-анализ на рандомизирани контролирани проучвания с не по-ниско качество. Arch Intern Med 2012; 172: 397-402.
7. Mega JL, Braunwald E, Wiviott SD, Bassand JP, Bhatt DL, Bode C et al. Ривароксабан при пациенти с скорошен остър коронарен синдром. N Engl J Med 2012; 366: 9-19.
8. Patel MR, Mahaffey KW, Garg J, Pan G, Singer DE, Hacke W et al. Ривароксабан спрямо варфарин при невалуарна предсърдна фибрилация. N Engl J Med 2011; 365: 883-891.
9. Di Nisio M, Middledorp S, Бюлер HR. Директни тромбинови инхибитори. N Engl J Med 2005; 353: 1028-1040.
10. Alexander JH, Singh KP. Инхибиране на фактор Ха: потенциална цел за разработване на нови антикоагуланти. Am J Cardiovasc Drugs 2005; 5: 279-290.
11. Kubitza D, Haas S. Нови инхибитори на фактор Ха за тромбоемболични заболявания. Expert Opin Investig Drugs 2006; 15: 843–855.
12. Haas S. Нови орални Xa и IIa инхибитори: актуализация на резултатите от клиничните изпитвания. J Thromb Haemost 2008; 25: 52-60.
13. Mann KG, Brummel K, Butenas S. За какво е тромбинът? J. Thromb Haemost 2003; 1: 1504-1514.
14. Turpie AG. Орални, директни инхибитори на фактор Ха в развитието за контрол на тромбоемболични заболявания. Arterioscl Thromb Vasc Biol 2007; 27: 1238-1247.
15. Connolly SJ, Ezekowitz MD, Yusuf S, Reilly PA, Wallentin L. Случайна оценка на дългосрочни антикоагулантни терапевти. Новооткритите събития в проучването RE-LY. N Engl J Med 2010; 363: 1875-1876.
16. Hohnloser SH, Oldgren J, Yang S, Wallentin L, Ezekowitz M, Reilly P et al. Миокардни исхемични събития при пациенти с предсърдно мъждене, лекувани с дабигатран или варфарин в проучването RE-LY. Circulation 2012; 125: 669-676.
17. Schulman S, Kearon C, Kakkar АК, Schellong S, Eriksson H, Baanstra D et al. Удължена употреба на дабигатран, варфарин или плацебо при венозна тромбоемболия. N Engl J Med 2013; 368: 709-18.
18. Tran A, Cheng-Lai A. Dabigatran етексилат. Първият перорален антикоагулант е наличен в САЩ след варфарин. Cardiol Rev 2011; 19: 154-161.
19. Artang R, Рим Е, Nielsen JD, Vidaillet HJ. Това е инхибитор на тромбина. Am J Cardiol 2013; 112: 1973-1979.
20. Skanes AC, Healey JS, Cairns JA, Dorian P, Gillis AM, McMurtry MS et al. Фокусирана 2012 актуализация: канадски сърдечно-съдови общества предсърдно мъждене насоки за контрол на ритъма. Can J Cardiol 2012; 28: 125-136.

антикоагулант

Антикоагулантите (антитромбиновите препарати) са клас лекарства, които действат за предотвратяване на коагулацията (коагулацията) на кръвта. Такива вещества естествено се произвеждат в пиявици и кръвосмучещи насекоми. Група от фармацевтични препарати, наречени антикоагуланти, могат да се използват под формата на инжекция за човек като лекарство за тромботични заболявания. Някои антикоагуланти се използват в медицинското оборудване, като епруветки, контейнери за кръвопреливане и хемодиализно оборудване.

приложение

Антикоагулантите намаляват съсирването на кръвта, което може да предотврати тромбоза на дълбоките вени, белодробна емболия, инфаркт на миокарда и исхемичен инсулт. Терапевтичната употреба на антикоагуланти включва предсърдно мъждене, белодробна емболия, дълбока венозна тромбоза, венозна тромбоемболия, застойна сърдечна недостатъчност, инсулт, инфаркт на миокарда и генетична или придобита хиперкоагулация. Решението за започване на терапевтична антикоагулация често включва използването на инструменти за оценка на очакваните рискове от множествено кървене, лекарите използват неинвазивна предварителна стратификация във връзка с възможността за кървене заедно с антикоагуланти. Сред тези инструменти са скала за оценка на риска от кървене, 1) ATRIA и скалата за оценка на риска от тромбоемболични усложнения при пациенти с предсърдно мъждене.

Странични ефекти

Пациентите на възраст над 80 години могат да бъдат особено податливи на хеморагични усложнения с интензивност от 13 кървене на 100 човешки години. Тези орални антикоагуланти се използват широко като отрови за земеделски вредители, особено за гризачи. (За подробности вижте родентициди и варфарин). Разделянето на витамин К с терапия с кумадин увеличава риска от калциране на артериите и сърдечната клапа, особено ако нивата на витамин D са твърде високи.

взаимодействие

Хранителни и хранителни добавки с антикоагулантни ефекти включват натокиназа, лумброкиназа, бира, боровинки, целина, боровинки, рибено масло, чесън, джинджифил, гинко билоба, женшен, зелен чай, конски кестен, сладко, ниацин, лук, папая, нар, червен детелина, соя, жълт кантарион, куркума, пшеница и върбова кора. 3) Много билкови добавки имат антикоагулантни свойства, като например червен градински чай и треска. Мултивитамини, които не взаимодействат с кръвосъсирването, могат да се използват от пациенти на антикоагуланти. Въпреки това, някои храни и добавки допринасят за коагулацията. Те включват люцерна, авокадо, котешки нокът, коензим Q10 и тъмни листни зеленчуци като спанак. Тяхната употреба трябва да се избягва, докато се приемат антикоагуланти или, ако се контролира съсирването на кръвта, тяхната употреба трябва да се поддържа на приблизително постоянно ниво, така че дозата на антикоагулантите да може да се поддържа на достатъчно ниво, за да се противодейства на този ефект, без да се променя съсирването на кръвта. Грейпфрутът взаимодейства с някои антикоагуланти, увеличавайки продължителността на времето, през което те трябва да бъдат отстранени от тялото, така че трябва да се използва с повишено внимание при лечение с антикоагуланти. Антикоагулантите често се използват за лечение на остра тромбоза на дълбоките вени. Хората, приемащи антикоагуланти за лечение на това заболяване, трябва да избягват почивка на леглото като допълнително лечение, тъй като клиничната ефикасност зависи от постоянното ходене и мобилността при използване на антикоагуланти по този начин. Почивката на леглото, докато приемате антикоагуланти, може да навреди на пациента в случаите, когато той не е медицински необходимо. 4)

Физични и химични свойства

По-новите перорални антикоагуланти (NOAC), включително дабигатран, ривароксабан и апиксабан, са също толкова ефективни или по-добри от кумарините (антагонисти на витамин К), с по-малко сериозни странични ефекти. Най-новите антикоагуланти (NOAC) са по-скъпи от традиционните антикоагуланти и трябва да се приемат с повишено внимание при пациенти с бъбречни проблеми. Освен това те нямат противодействащ агент, поради което е трудно да се спре действието им върху тялото в случай на крайно необходимост (авария, аварийна операция). Точното спазване на указанията за тази терапия е от първостепенно значение за оптималното действие.

Кумарини (антагонисти на витамин К)

Тези перорални антикоагуланти са получени от кумарин, който се намира в много растения. Основният представител на този клас е варфарин (Coumadin). Отнема най-малко 48 до 72 часа, за да се получи антикоагулантния ефект. Ако е необходимо незабавно действие, хепарин може да се приема едновременно. Тези антикоагуланти се използват за лечение на пациенти с дълбока венозна тромбоза (ДВТ), белодробна емболия (ПЕ) и за предотвратяване на емболия при пациенти с предсърдно мъждене (АФ), както и с механични сърдечни клапи. Други примери включват аценокумарол и фенпрокумон, атроментин и фенилдион. Бродифакум и дифенакум кумарини се използват като родентициди, но не се използват за медицински цели.

Хепарин и производни

Хепаринът е биологично вещество, обикновено получено от свинските черва. Той действа чрез активиране на антитромбин III, който предотвратява съсирването на кръвта с тромбин. Хепарин може да се използва in vivo (чрез инжектиране), както и в лабораторни условия, за предотвратяване на кръв или плазма от съсирване и в медицинско оборудване. При венепункция, съдържащите хепарин вакуумни тръби за събиране на кръв обикновено имат зелена капачка.

Хепарин с ниско молекулно тегло

Хепарин с ниско молекулно тегло, най-широко използваният продукт, е ефективен, защото не изисква мониторинг на индекса на коагулация на aPTT (има по-предсказуемо плазмено ниво) и има по-малко странични ефекти.

Синтетични пентазахаридни инхибитори на фактор Ха

Директни инхибитори на фактор Ха

Лекарства като ривароксабан, апиксабан и едоксабан действат чрез инхибиране на фактор Ха директно (за разлика от хепарините и фондапаринукс, които действат чрез активиране на антитромбин). Включени са също бетриксабан (LY517717), произведен от Portola Pharmaceuticals, dareksaban (YM150), произведен от Astellas, и по-нови TAK-442 letaxaban (Takeda) и airbaxaban (PD0348292) (Pfizer). Развитието на дарексабан е преустановено през септември 2011 г.: в проучване за предотвратяване на рецидиви на миокарден инфаркт в края на двойната антитромбоцитна терапия, лекарството не показва ефикасност и рискът от кървене е увеличен с около 300%. Развитието на летаксабан за остър коронарен синдром е преустановено през май 2011 г. поради отрицателни резултати във фаза II на проучването. 5)

Директни тромбинови инхибитори

Друг вид антикоагуланти е представен от директни тромбинови инхибитори. Съвременните членове на този клас включват бивалентните лекарства хирудин, лепирудин и бивалирудин; едновалентни лекарства включват аргатробан и дабигатран. Директният орален тромбинов инхибитор ximelagatran ("Exanta") не е одобрен от Агенцията по храните и лекарствата на САЩ (FDA) през септември 2004 г. и е напълно изтеглен от пазара през февруари 2006 г. след съобщения за тежки увреждания на черния дроб и сърцето. атаки. През ноември 2010 г. дабигатран е одобрен от FDA за лечение на предсърдно мъждене.

Терапевтични средства за антитромбинов протеин

Антитромбиновия протеин, използван като протеинов терапевтичен агент, може да бъде изолиран от човешка плазма или произведен изкуствено (например, атрин, произведен от млякото на генетично модифицирани кози 6)). Антитромбинът е одобрен от FDA като антикоагулант, за да се предотврати образуването на кръвни съсиреци преди, по време или след операция или раждане при пациенти с вроден дефицит на антитромбин.

Други видове антикоагуланти

Има много антикоагуланти, които се използват при изследване и развитие, диагностика или като кандидати за лекарства.

Общество и култура

Варфарин (Coumadin) е основният агент, използван в САЩ и Обединеното кралство. Аценокумарол и фенпрокумон се използват по-често извън Съединените щати и Обединеното кралство.

Лабораторна употреба

Лабораторните инструменти, контейнерите за кръвопреливане, както и медицинското и хирургическо оборудване ще се запушат и ще станат неизползваеми, ако кръвта може да се съсири. В допълнение, химикали, които предотвратяват кръвосъсирването, се добавят към епруветките, използвани в лабораторни кръвни тестове. Освен хепарин, повечето от тези химикали действат чрез свързване на калциеви йони, предотвратявайки използването им като коагулантни протеини.

Антикоагуланти: механизъм на действие на лекарства, индикации и противопоказания за употреба

Според статистиката, различни тромбоемболични усложнения (белодробна емболия, дълбока венозна тромбоза) заемат едно от водещите места в структурата на смъртността в Русия. В медицината антикоагулантите се използват за лечение на такива състояния - вещества, които възпрепятстват образуването на тънки влакна от фибрин под влияние на коагулационните фактори, инхибират растежа на вече образувания кръвен съсирек и повишават активността на ензимите вътрешен фибринолитичен (насочен към резорбция на кръвен съсирек).

В момента класификацията на антикоагулантите се основава на точките на приложение на техните ефекти в организма. Има наркотици:

  • Директно действие (напр. Хепарин). Действат бързо, ефектът им е свързан с пряк ефект върху кръвосъсирването чрез образуване на комплекси с различни фактори на коагулация и инхибиране на трите фази на коагулация.
  • Непряко действие (антагонисти на витамин К). Те действат дълго време, но след латентен ("мълча") период спират активирането на ензима, участващ в превръщането на витамин К, като по този начин спират производството на зависими от витамин плазмени коагулационни фактори (II, VII, IX, X).

Нефракционираният хепарин (UFH) е естествено вещество, получено от органите на домашните животни. Неговият механизъм на действие се основава на способността да се свързва с антитромбин и по този начин да повишава неговата способност да дезактивира фактори на съсирването IIa, IXa, Ха, Xla, XIIa. Тромбин (фактор IIa) е особено чувствителен към ефектите на хепарин-антитромбиновия комплекс.

Действието на хепарина се осъществява изключително, когато се прилага парентерално: след интравенозно приложение активността веднага се забелязва, когато се прилага подкожно, след 20-60 минути с бионаличност от 10-40% (т.е. само този процент от веществото достига системното кръвообращение). Поради факта, че нефракционираният хепарин се свързва с плазмените протеини, това лекарство често проявява непредсказуем антикоагулационен ефект. За създаване и поддържане на необходимата терапевтична концентрация на хепарин в кръвта е необходимо постоянно интравенозно приложение или редовни подкожни инжекции, като се отчита бионаличността. За да се контролира лечението, е необходимо да се определи активираното парциално тромбопластиново време (APTT), чиито индикатори трябва да останат в диапазона от 1.5-2.3 от контролната стойност.

Хепарините с ниско молекулно тегло (LMWH) са химически или ензимно обработени нефракциониран хепарин. Механизмът на действие е подобен на UFG, но LMWH е значително по-активен срещу коагулационния фактор Ха, отколкото тромбин. При интравенозно приложение максималната активност се проявява след 5 минути, с подкожно приложение - след 3-4 часа с бионаличност повече от 90%, следователно, за да се поддържа стабилно ниво на антикоагулантна активност на плазмата, не е необходимо да се провежда непрекъсната интравенозна инфузия, за разлика от UFH. Дозирането на лекарството се извършва индивидуално под контрола на анти-Ха кръвната активност.

Натриев Фондапаринукс е лекарство, което селективно деактивира коагулационния фактор Ха. Бионаличността на субстанцията след подкожно приложение е 100% и активността се поддържа 17-21 часа, следователно еднократна подкожна инжекция е достатъчна за постигане на терапевтична концентрация.

Бивалирудин е вещество, което директно инхибира активността на тромбина, единственото лекарство с подобен ефект, регистрирано за парентерално приложение в Русия. Действието му е насочено не само към циркулиращия в кръвта тромбин, но и към тромбина вътре в образувания тромб. Лекарството се прилага изключително интравенозно, а времето на неговата дейност е само 25 минути. Предписаните дози са фиксирани и не изискват мониторинг на параметрите на кръвосъсирването.

Фактор ха инхибитори

Описано е съединение с неестествен произход, специфично инхибиращо активността на фактор Ха, имащо общата формула (I) А1-А2- (АЗ).m-В, където m = 0 или 1; A1 - R1-R2-R3; A3 - R7-R8-R9; R1 избран от групата, състояща се от R '1-X-R1"където X е N и R"1 и R "1 независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, ацил, арил, арилалкил и амино-защитни групи; R2 - -CR99R100, където r99 и R100 R 'са независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил и хетероарил; R3 - -С (О) - или -СН2-; R4 - -NR50-, където r50 - Н; R5 - -CR201R202, където r201 и R202 R 'и R5 са независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арил и арилалкил; R6 - -С (О) или -СН2-; R7 - -NR51, където r51 - Н; R8 - -CR210R211-, където r210 и R211 R5 и R5 са независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил и хетероцикъл, и алкил, алкиларил и хетероцикъл могат да бъдат заместени с Q или - (СН2)п-Q, където п = 1-5 и Q е избран от групата, състояща се от амино, амидинови, имидазолови и гуанидинови групи, които могат да бъдат заместени, и моно-, ди-, три- или тетраалкиламониеви фармацевтично приемливи соли, негов изоуреид или изотиоуреид; R9 - -С (О) - или -СН2-; В - -NHR52, където r52 е избран от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил, хетероарил, една или две аминокиселини, или тяхна фармацевтично приемлива сол, амид, естер, алкохол или алдехид. Съединението с формула (I) предотвратява образуването на кръвни съсиреци, като специфичен нискомолекулен инхибитор на фактор Ха, е ефективен, но не предизвиква нежелани странични ефекти. 8 s. и 20 к.с. F-ly, 5 tab., 4 Il.

Изобретението се отнася най-общо до инхибиране на протеини от кръвни съсиреци и по-специално до специфични инхибитори на фактор Ха на кръвосъсирващата система.

Способността за образуване на кръвни съсиреци е от съществено значение за оцеляването. При някои заболявания обаче образуването на кръвни съсиреци в кръвоносната система само по себе си е източник на болестност. По този начин понякога е желателно да се предотврати образуването на кръвни съсиреци. Въпреки това пълното инхибиране на системата за кръвосъсирване е нежелателно, тъй като ще последва животозастрашаващо кървене.

За да се намали интраваскуларното образуване на кръвни съсиреци, експертите са разработили ефективен инхибитор на протромбиназа или фактор Ха, който се въвежда в протромбиназния комплекс, в който активира тромбина по време на образуването на съсиреци.

Подходящите концентрации на инхибитор на фактор Ха ще повишат нивото на средства, образуващи протромбиназа, необходими за иницииране на образуването на съсиреци, но няма да причинят ненужно удължаване на кръвосъсирването, веднага щом се достигне праговата концентрация на тромбина. Обаче, въпреки дългогодишното признаване на желанието за създаване на такъв инхибитор, понастоящем в клиничната практика няма ефективен специфичен инхибитор на фактор Ха.

В много клинични области съществува необходимост от антикоагулантно лечение.

Понастоящем наличните лекарства в много клинични области са незадоволителни. Например, почти 50% от пациентите, които са претърпели пълна смяна на тазобедрената става, развиват дълбока коронарна тромбоза (GWT).

В приетата терапия се използва фиксирана доза от нискомолекулен хепарин (LMWH) и променлива доза хепарин. Дори и при такива схеми на лечение, 10-20% от пациентите развиват GWT и 5-10% развиват усложнения с кървене.

Друга клинична ситуация, при която се изискват по-ефективни антикоагуланти, е пластичната операция на коронарните съдове с повишен риск от миокарден инфаркт или стенокардия.

Съвременната конвенционална терапия, която включва използването на хепарин и аспирин, е свързана с 6-8% от случаите на съдова оклузия по време на 24-часовата процедура. Скоростта на усложнения от кървене, изискващи преливане на кръв поради употребата на хепарин, също е около 7%.

Освен това, въпреки че доста голям брой от случаите са без задръстване на съдовете, употребата на хепарин след края на процедурата е неефективна и може да бъде неблагоприятна.

Най-широко използваните инхибитори на кръвосъсирването са хепарин и свързаните със сулфа полизахариди, LMWH и хепаринсулфат. Молекулите на тези съединения проявяват антикоагулантни свойства чрез насърчаване на свързването на естествения регулатор на коагулационния процес, антитромбин III, с тромбин и фактор Ха. Инхибиторната активност на хепарина първоначално е насочена срещу тромбин, който е инактивиран около 100 пъти по-бързо от фактор Ха. Въпреки, че в сравнение с хепарин, хепаринсулфат и LMWH са по-ефективни инхибитори на Ха, отколкото в случая на тромбин, разликата in vitro е малка (3-30 пъти) и ефектът in vivo може да бъде променлив. Хирудин и хирулог са антикоагуланти, специфични за тромбин, използвани в съвременните клиники. Обаче, тези антикоагуланти, които инхибират тромбина, също могат да причинят кървене.

Предклиничните проучвания върху бабуини и кучета показват, че специфични инхибитори на фактор Ха предотвратяват образуването на съсиреци, без да предизвикват кръвотечение, наблюдавано при използване на директни инхибитори на тромбин. Такива инхибитори на фактор Ха включват, например, 2.7-бис- (4-амидинобензилиден) циклохептанон и Na-тозилглицил-3-амидинофенилаланин метилов естер ("TENSTOP"), ефективните инхибиторни концентрации (Ki), от които са 20 nm и 800 nm, съответно, ( +) - (2S) -2- (4 ( <(3S)-1-ацетимидоил-3-пирролидинил>окси) фенил) -3- (7-амидино-2-нафтил) пропанова киселина е също член на класа на инхибиторите на фактор Ха (Katakura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 197: 965-972 (1993)). Тези съединения обаче не се използват в клиничната практика.

Специфични протеинови инхибитори на фактор Ха са също открити и включват, например, антистазин (АТС) и антикоагулантния пептид, изолиран от кърлеж (CAP). ATC, който е изолиран от пиявицата Haementerin officinalis, съдържа 119 аминокиселини и има Каз за фактор Ха, равен на 0.05 nm. CAP, изолиран от акарите Ornithodoros moubata съдържа 60 аминокиселини, като Ki за фактор Ха е приблизително 0.5 nm.

Ефективността на получените рекомбинантни АТС и ОСП се изследва в редица животни. И двата инхибитора намаляват времето на кървене в сравнение с други антикоагуланти и предотвратяват съсирването на кръвта, когато се тестват върху модел на коронарна тромбоза, причинена от тромбопластин в лигатирани вратни вени.

Резултатите, получени на този модел, са корелирани с резултатите, получени при използването на популярното в момента лекарство, хепарин.

Установено е също, че подкожното приложение на АТС е ефективно при тестване на модел на дисеминирана интраваскуларна коагулация (RVC), причинена от тромбопластин. CAP ефективно предотвратява артериалната тромбоза и "намаленият кръвен поток", причинени от хирургичното въвеждане на полиестер ("DACRON") имплант, в дози, които осигуряват клинично приемливо удължаване на активираното парциално тромбопластиново време (aHTP), т.е. по-малко от два пъти. За сравнение, стандартният хепарин, дори при дози, които предизвикват петкратно увеличение на acHTP, не предотвратява тромбоза и намален приток на кръв вътре в импланта. ATPP е клиничен коагулационен тест, който е особено чувствителен към тромбинови инхибитори.

АТС и КАП не намериха приложение в клиниката. Един от важните недостатъци на тези два инхибитора е, че прилагането на необходимите повторни дози причинява образуването на неутрализиращи антитела, като по този начин се ограничава тяхната клинична употреба.

Освен това, размерът на ОСП и АТС прави оралното приложение невъзможно, ограничавайки броя на пациентите, които могат да се възползват от тези агенти.

Специфичен инхибитор на фактор Ха ще бъде от практическо значение в медицината. По-специално, инхибиторът на фактор Ха ще бъде ефективен при обстоятелства, при които използваните полизахариди, съдържащи хепарин и сулфа, са неефективни или слабо ефективни. Следователно, съществува необходимост от създаване на специфичен инхибитор с ниско молекулно тегло на фактор Ха, който предотвратява образуването на кръвни съсиреци, който е ефективен, но не предизвиква нежелани странични ефекти.

Това изобретение удовлетворява тази необходимост и осигурява желаните ползи.

Това изобретение се отнася до съединения, които специфично инхибират активността на фактор Ха.

Съединението от изобретението има структурата X1-Y-I-R-X2, където е x1 "Водород" означава водород (Н), ацил, алкил или арилалкил, или една или повече аминокиселини и X2 "Модифицирана" означава модифицирана С-крайна последователност, една или повече групи, защитаващи карбоксилната група (виж по-долу), една или повече аминокиселини или други заместители, и Y, I и R се отнасят съответно до аминокиселини - тирозин, изолевцин и аргинин, и до пептидомиметик или органични структури със същата функционална активност като тирозин, изолевцин и аргинин, съответно. В допълнение, съединението съгласно изобретението има структура А1-А2- (A3)m-В, както е посочено в това описание.

Съединението от изобретението може да бъде линейно или циклично, съдържащо от около 2 до около 43 остатъка по дължината на молекулата и модифицирани с N-съдържащи и / или С-съдържащи терминални последователности. Такива съединения проявяват специфично инхибиране на активността на фактор Ха с Ki-C3Н7N) -Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-PalMe (3) -NH2; Tyr-Ile-Arg-NH2; (D) -Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac- (Bzl) Gly- (СНх) Gly- (3-гуанидопропил) Cly-NH2; Cyclo (Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa- (iBu) Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Nal (2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Palme (3) -NH2; и техните фармацевтично приемливи соли и производни с крайни С-съдържащи групи, например, амиди, естери, алкохоли и алдехиди (виж също таблица 5).

Изобретението осигурява методи за специфично инхибиране на активността на фактор Ха и инхибиране на съсирването на кръвта в индивид. Осигурени са също методи за определяне на нива на фактор Ха или активност.

Фиг. 1 е схематична диаграма на каскадата на кръвосъсирването.

Фиг. 2 показва пример за структурата на съединение от изобретението.

Фиг. 3А, В показват реакционните схеми за получаването на определени съединения съгласно изобретението.

Коагулацията на кръвта е сложен процес, включващ серия от прогресивно размножаващи се ензимни активационни реакции, при които плазмените зимогени се активират последователно чрез ограничена протеолиза. Механично, каскадното кръвообращение се разделя на вътрешни и външни цикли, които се събират, когато се активира фактор Ха; последващото образуване на тромбин протича през един общ цикъл (виж фиг. 1).

Настоящото изследване предполага, че вътрешният цикъл играе важна роля в поддържането и отглеждането на образуването на фибрин, докато външният цикъл е критичен в фазата на започване на кръвосъсирването. Общоприето е, че кръвосъсирването започва физически след образуването на комплексния тъканен фактор / фактор VIIa. Веднага след образуването, този комплекс бързо инициира коагулация чрез активиране на фактори IX и X. След това новообразуваният фактор Ха образува 1: 1 комплекс с фактор Va и фосфолипиди за образуване на протромбиназен комплекс, който е отговорен за превръщането на разтворимия фибриноген в неразтворим фибрин. С течение на времето, активността на комплекса фактор VIIa / тъканен фактор (външен цикъл) се инхибира от протеазен инхибиторен протеин от типа Kunitz, TFPI, който, когато образува комплекс с фактор Ха, може директно да инхибира протеолитичната активност на комплекса фактор Vlla / тъканен фактор.

За да се подпомогне коагулационния процес в присъствието на инхибирана външна система, фактор Ха се произвежда допълнително поради активността на вътрешния цикъл, медииран чрез тромбин. По този начин, тромбинът играе двойна автокаталитична роля, осъществявайки собствено производство и превръщане на фибриноген в фибрин.

Автокаталитичният характер на образуването на тромбин е важна гаранция срещу нерегулираното кървене и гарантира, че при достигане на тази прагова концентрация на протромбиназа, до края ще настъпи коагулация на кръвта, което ще доведе например до края на кървенето.

По този начин, най-желателно е да се създадат агенти, които инхибират коагулацията без директно инхибиране на тромбин.

Това изобретение осигурява YIR пептиди, които са съединения, които инхибират активността на фактор Ха, и на практика не инхибират активността на други протеази, участващи в процеса на кръвосъсирването.

Терминът "съединение" или "YIR пептид", както се използва тук, се отнася до неестествен Tyr-Ile-Arg (YIR) пептид и неговите аналози и миметици, които могат да инхибират активността на фактор Ха.

Самата YIR последователност тук се нарича "YIR фрагмент" и се състои от тирозин-изолевцин-аргинин трипептид или негов функционален еквивалент, например, pAph-Chg-PalMe (3), pAph-Chg-PalMe (3) -NH2 и pAph-Chg-AMP (4) (виж съкращенията в Таблица 1).

Такива съединения съгласно изобретението съдържат най-малко един YIR фрагмент или негов функционален еквивалент и са в състояние специфично да инхибират активността на фактор Ха. За удобство, терминът "съединение" и "YIR пептид" тук са широко използвани за означаване на пептидите от изобретението, включително функционални еквиваленти като пептидни аналози, миметични пептиди и синтетични органични съединения. Функционалният еквивалент на YIR пептида от изобретението може да бъде характеризиран отчасти като притежаващ структурата, описана в тази спецификация и Ki стойност от 100 цМ за инхибиране на активността на фактор Ха (виж пример XXXVII).

Пептидните аналози на YIR пептида съгласно изобретението включват, например, пептиди, съдържащи неприродни аминокиселини или химически модифицирани аминокиселини, при условие, че съединението запазва инхибираща активност срещу фактор Ха (например, виж таблица 2). Подобно, миметичните пептиди представляват химични структури, които не са аминокиселини и които имитират структурата на YIR пептида от изобретението и запазват инхибиторната активност срещу фактор Ха. Такива миметици обикновено се характеризират като проявяващи подобни физични свойства, такива като размер, заряд или хидрофобност, които са представени в подходяща пространствена ориентация, както се намира в противоположния йон на конвенционален YIR пептид. Специфичен пример за миметичен пептид е съединение, в което амидната връзка между една или няколко аминокиселини е заменена, например, от въглерод-въглеродна връзка или друга връзка, както е добре известно в областта (виж, например, Sawyer в Peptide Based Drug Design pp 387- 422 (ACS, Washington DC 1995) Така изобретението осигурява съединения, които инхибират фактор Ха, който има структура А1-А2- (А3).m-В, където m = 0 или 1, описани по-долу. Примери за такива пептиди, които могат да бъдат миметични, са дадени в тази спецификация.

Терминът "аминокиселина" се използва в най-широк смисъл, за да се отнася до двадесет естествено срещащи се аминокиселини, които са преведени от генетичен код и се състоят от блокове от протеини, включително, ако не е посочено друго, L-аминокиселини и D-аминокиселини, както и химически модифицирани аминокиселини, такива като аминокиселини. аналози, естествено срещащи се аминокиселини, които обикновено не се въвеждат в протеини, например, норлевцин и химически синтетични съединения със свойства, характерни за аминокиселини. Например, аналози или миметици на фенилаланин или пролин, които позволяват същото конформационно ограничение на пептидите като естествен Phe или Pro, са включени в дефиницията на "аминокиселини" и са добре известни на специалистите.

Такива аналози и миметици са посочени тук като "функционални еквиваленти" на аминокиселини. Други примери на аминокиселини и техните аналози са дадени от Roberts и Vollaccio (The Peptides: Analysis, Sunthesis, Biology, Eds Grass и Meienhofer, Vol.5, p.341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983). Съкращения на аминокиселини, аналози на аминокиселини и миметици са показани в Таблица 1.

Както се използва в тази спецификация, терминът "Ха активност" се отнася до способността на фактор Ха, самостоятелно или в комбинация с субединици, известни като протромбиназен комплекс, да катализира превръщането на протромбин в тромбин. Когато се използва във връзка с активността на фактор Ха, терминът "инхибиране" означава както пряко, така и непряко инхибиране на активността на фактор Ха. Директното инхибиране на активността на фактор Ха може да бъде постигнато, например, чрез свързване на YIR пептида от изобретението с фактор Ха или протромбиназа, за да се предотврати свързването на протромбин с активния център на протромбиназния комплекс. Непрякото инхибиране на активността на фактор Ха може да бъде постигнато, например, чрез свързване на съединението от изобретението с разтворим фактор Ха, за да се предотврати неговото включване в протромбиназния комплекс.

Както се използва във връзка с инхибиращата активност на фактор Ха, терминът "специфичен" означава, че YIR пептидът може да инхибира активността на фактор Ха без да упражнява инхибиращ ефект върху активността на други специфични протеази, включително плазмин и тромбин (при същата концентрация на инхибитор). Такива протеази са включени в кръвосъсирването и каскадната фибринолиза (виж таблица 2; виж също Пример XXVII).

Резултатите в таблица 2 показват, че YIR пептидите от изобретението са подходящи като инхибитори на фактор Ха, но не инхибират по същество активността на други серинови протеази, като тромбин или плазмин, които участват в процеса на кръвосъсирване и фибринолиза.

Както се използва тук, терминът "заместител" се отнася до всяка от различните химични групи, които са въведени в основната верига на пептид или странична верига на пептид, пептиден аналог, миметик или органично съединение, описано тук. Заместител може да бъде всеки известен на специалистите в областта (виж, например, Giannis и Kolter, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 1244-1267 (1993)). В тази спецификация са дадени многобройни примери, показващи различни заместители, включително, например, въвеждането на pNH2 заместител във фенилаланин, за да се получи F (pNH2) и въвеждането на халоген в тирозин с получаване, например, Y (3-1) или Y (3,5-1). В допълнение, заместителят може да бъде, например, хетероатом, като азот (N; виж например Pal), кислород (О; виж, например, О-метил тирозин) или сяра (S; виж, например, Tyr (SO)3Н)), който може да съдържа заместител. Така, N-, S- или О-съдържащ фрагмент, като -SO3H, се счита за заместник.

В допълнение, заместителят може да бъде група, която защитава амино групата или карбоксилната група.

Както се използва тук, терминът "алкил" се използва в най-широк смисъл за означаване на наситени или ненаситени, линейни, разклонени или циклични вериги с около 1-13 С атоми.Така, терминът "алкил" включва, например, метил, етил, п-пропил, изопропил сек-бутил, 1-метилбутил, 2,2-диметилбутил, 2-метилпентил, 2,2-диметилпропил, п-пентил и п-хексил, алкилен групи, карбоциклични групи, като циклохексил и циклопентил, както и комбинации от линейни или разклонени вериги и карбоциклични вериги, такива като метилциклохексил или цис lopropil-метилен. В допълнение, трябва да се има предвид, че алкилът може да съдържа заместител. Подобно, терминът "ацил" се използва в най-широк смисъл за означаване на наситени или ненаситени, линейни, разклонени или циклични вериги с около 1-13 въглеродни атома, които съдържат карбоксилна група. Така, терминът "ацил" включва, например, такива групи като формил, ацетил, бензоил и други подобни.

Терминът "арил" се отнася до ароматни групи, съдържащи 5-13 въглеродни атоми и поне един "пръстен", имащ спрегната система от пи-електрони. Примери за арил са, например, хетероциклични арилови групи, диарилови групи, техни аналози и производни, които могат да съдържат един или повече заместители.

Терминът "арилалкил" се отнася до алкил, както е дефиниран по-горе, заместен с арилова група. Подходящи арилалкилови групи включват бензил, пиколил и други подобни, всички от които могат да бъдат заместени.

Термините "хетероалкил", "хетероарилалкил" и "хетероарил" също се използват в това описание и се отнасят съответно до алкил, арилалкил и арил, които са заместени с един или повече хетероатоми, като N, О, или S атоми. Използва се във връзка с циклична алкилова или арилова група, която е заместена с един или повече хетероатоми. Много примери на хетероалкили, хетероарилалкили, хетероарили и хетероцикли са дадени, например, в Таблици 1 и 3, и също така известни от предшестващото състояние на техниката.

Пептидите от изобретението могат да бъдат модифицирани чрез крайни N- или С-съдържащи последователности, използвайки група, която замества съответно амино група или карбоксилна група.

Многобройни примери за такива модификации са дадени в тази спецификация (виж, например, таблица 3). N-съдържащата крайна група на пептид или пептиден аналог може да бъде химически модифицирана, така че крайната амино група да бъде заместена, например, с ацетилова, циклопентилкарбоксилна, изохинолилкарбоксилна, фурилова, тозил, пиразинкарбоксилна или друга подобна група, която може да бъде заместена със заместител, както е описано по-горе. Крайната амино група може също да бъде заместена, например, с обратима амидна връзка. Трябва да се има предвид, че терминът "амино група" е използван тук в широк смисъл за означаване на всяка свободна амино група, включваща първичната, вторичната или третичната аминогрупа, присъстваща в пептида. В сравнение с това, "N-крайната" последователност означава алфа-амино групата на първата аминокиселина, съдържаща се в пептида, формулата на която е написана по конвенционален начин.

N-крайната група на пептид съгласно изобретението може да бъде защитена чрез прикрепване към нея на аминозащитна група. Терминът "защита на аминогрупата" се използва тук в широк смисъл за означаване на химична група, която може да реагира със свободна аминогрупа, включително, например, алфа-амино група, разположена в края на пептидна молекула от изобретението. Взаимодействайки с последната, защитната група защитава иначе реактивната амино група от нежелани реакции, които могат да възникнат, например, по време на синтеза или поради активността на екзопептидаза в крайното съединение. Модифицирането на аминогрупата може също да осигури допълнителни ползи, включително, например, повишаване на разтворимостта или активността на съединението. Това описание описва различните групи, защитаващи аминогрупата (виж Таблица 3), както и те са известни в областта и включват, например, ацилни групи като ацетил, пиколил и настъргани. бутилацетил, настърган бутилоксикарбонил, бензилоксикарбонил, бензоил, включително, например, бензилоксим, такъв като 2-арил-2-О-бензилоксим (виж Пример XVI), както и аминоацилов остатък, който сам по себе си може да бъде модифициран от групата, защитаваща аминогрупата. Други защитни групи на амино групи са описани, например, в The Peptides, eds.Gross and Meinhofer, Vol.3 (Academic Press, Inc., N. Y., 1981); и Green and Wuts, "Защитни групи в органичен синтез, 2-ро издание, стр. 309-405 (John Wiley and Sons, New York (1991)). Продуктът на всяка такава модификация на крайната аминогрупа на пептид или пептиден аналог на изобретението е посочен в описанието за "N-краен дериват".

По подобен начин, карбоксилна група, съдържаща като С-терминал в пептида, може да бъде химически модифицирана, използвайки карбокси защитна група. Терминът "карбоксилна група" и "С-терминал" се използват по аналогия с термините "амино група" и "N-терминал", както е посочено по-горе.

Карбоксилна група, такава като тази, съдържаща се в С-терминалната група на пептида, може да бъде модифицирана чрез редуциране на С-крайната карбоксилна група до алкохол или алдехид, или чрез образуване на зъбен естер или заместване на карбоксилната група със заместител като тиазолил, циклохексил или друга група. Денталните естери са добре известни и включват, например, алкоксиметилови групи, като метоксиметил, етоксиметил, изопропоксиметил и други подобни, алфа- (С)1-C4алкоксиетили като метоксиетил, етоксиетил, пропоксиетил, изопропоксиетил и други подобни; 2-оксо-1,3-диоксилен-4-илметилови групи, като 5-метил-2-оксо-1,3-диоксилен-4-илметил и други подобни; C1-C3-алкилтиометили като метилтиометил, етилтиометил, изопропилтиометил и други подобни; ацилоксиметилови групи като пивалилоксиметил, алфа-ацетоксиметил и други подобни; етоксикарбонил-1-метилова група; алфа-ацилокси-алфа-заместени метилови групи, като алфа-ацетоксиетил, 3-фталидил или 5,6-диметилфталидил, 1- (С1-C4-алкилоксикарбонилокси) ет-1-ил групи като 1- (етоксикарбонилокси) ет-1-ил; и 1- (С1-C4-алкиламинокарбонилокси) ет-1-илова група като 1- (метиламинокарбонилокси) ет-1-ил.

Пептидът от изобретението може да бъде модифициран чрез добавяне на карбоксилна защитна група. Карбоксилните защитни групи са добре известни и, когато са прикрепени към пептид, защитават карбоксилната група срещу нежелани реакции (виж, например, Greene and Wuts, по-горе, стр. 224-276 (1991)).

Известно е на специалистите в областта, че описаните по-горе модификации, които могат да бъдат извършени с N-крайната амино група или С-терминалната карбоксилна група на пептида, могат по подобен начин да бъдат извършени с всяка реактивна амино група или карбоксилна група, присъстваща, например, в страничната верига на аминокиселина или аналог на аминокиселина в пептид съгласно изобретението. Методите за извършване на такива модификации са описани по-долу и също са известни в областта.

Това изобретение осигурява съединения, които специфично инхибират активността на фактор Ха. Съединението от изобретението има общата структура X1-YIR-Х2 или е негов функционален еквивалент, където X1 "Х" означава Н, ацил, алкил, арилалкил или една или повече аминокиселини и X2 "Синтез" означава модифицирана С-крайна група, една или повече групи, защитаващи карбоксилната група, или една или няколко аминокиселини или друг заместител, като групата, защитаваща аминогрупата.

Съединението от изобретението е полезно като антикоагулант при терапевтичното лечение на различни клинични заболявания. Съединението от изобретението е също така подходящо за различни лабораторни тестове за предотвратяване на съсирването на кръвни проби.

Изобретението осигурява също съединение, което специфично инхибира активността на фактор Ха и има обща формула А1-А2- (А3).m-В, където m = 0 или 1 и А1 означава R1-R2-R3, А2 означава R4-R5-R6 и А3 означава R7-R8-R9; където r1 избран от групата, състояща се от 1-20 аминокиселини; X е избран от групата, състояща се от N, СН и NC (О) и R '1, R ''1 избран от групата, състояща се от алкил, ацил, арил, арилалкил и групи, защитаващи аминогрупата и където R1 могат да бъдат заместени; R2 "-CR" означава -CR99R100, където r99 и R100 и R 'независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил и хетероарил, и където R99 и R100 независимо един от друг могат да бъдат заместени; R3 избран от групата, състояща се от -С (О) -, -СН2-, -CHR99-С (О) - и -С (О) -NR35-СН2-C (O) -, където R35 означава Chr55 мостова група - С (О) -CR55-; R4 избран от групата, състояща се от -СН2- и -NR50-, където r50 избран от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил и хетероцикъл; R5 означава = CR201R202, където r201 и R202 и R ', независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арил и арилалкил, и където R201 и R202 независимо един от друг могат да бъдат заместени; R6 "заместител" означава заместител, избран от групата, състояща се от -С (О), -СН2- и -chr99-С (О) -; R7 избран от групата, състояща се от -СН2- и -NR51, където r51 "Алкил" означава Н, алкил, арилалкил, хетероалкил и хетероарилалкил и всеки от тези радикали е заместен със заместител, избран от групата, включваща Q и - (СН).2)п-Q, където п = 1-5 и Q е избран от групата, състояща се от амино, амидинови, имидазолови и гуанидинови групи, които могат да бъдат заместени, и моно-, ди-, три- или тетраалкиламониеви фармацевтично приемливи соли, негов изоуреид или изотиоуреид; R8 "-CR" означава -CR210R211-, където r210 и R211 и R5 са независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, алкиларил и хетероцикъл, всеки от тези радикали е заместен по избор със заместител, избран от групата, включваща Q или - (СН).2)п-Q, където п = 1-5 и Q е избран от групата, състояща се от амино, амидинови, имидазолови и гуанидинови групи, които могат да бъдат заместени, и моно-, ди-, три- или тетраалкиламониеви фармацевтично приемливи соли, негов изоуреид или изотиоуреид; R9 избран от групата, състояща се от -С (О) -, -СН2- и -chr99-С (О); и където, когато m = 1, В е избран от групата, състояща се от 1-20 аминокиселини, -NHR52, -NR60R61-, ИЛИ70 и -chr60R61, където r52 избран от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил и хетероарил; където r60 и R61 независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, арил, хетероарилалкил и където, когато m = 0, В е избран от групата, състояща се от 1-20 аминокиселини, -OR70, -NHR52 и NR60R61, който е прикрепен към R6 амидна връзка или естерна връзка; където В може да бъде заместен със заместител, при условие, че когато R3 означава -СН2- или -chr99-С (О) -, R4 означава NR50; когато r4 означава -СН2-, R3 "Алкил" означава -С (О) - или - chr99-С (О) -, R4 означава NR50; когато r4 означава -СН2-, R3 "Алкил" означава -С (О) - или -chr99-С (О) -; когато r6 означава -СН2-, R7 означава -NHR51-; когато r7 означава -СН2-, R6 "Алкил" означава -С (О) - или -chr99-С (О) -; когато r4 означава -NR50- и R1 означава R50 и r '1 Съединенията образуват мостова група с формула -C (O) -chr55-, където е chr55 R е R50 и карбонилната група е R '1, и R "1 и R55 независимо означават Н, С1-C6-алкил или арилалкил; и когато r3 "Алкил" означава -С (О) -NR35-СН2-С (О) -, след това R4 означава -NR50-, R1 означава R35 и r '1 Съединенията образуват мостова група с формула -C (O) chr55-, където С (О) е R '1 и chr55 R е R35; R ''1 и R55 независимо означават Н или С1-C6-алкил (виж, например, Фиг. 2).

Съединението от изобретението може да съдържа циклична N-крайна група, образувана от R1, R2, R3 и, ако е желателно, R4. Такова съединение е означено, например, със структурата А1-А2- (A3)m-В, както е описано по-горе, където R4 означава -NR50-, R1 означава R50 и r '1 Съединенията образуват мостова група с формула -C (O) -chr55, където r55 означава Н; R1 R3 е Н или метил; R99 и R100 и R 'независимо избрани от групата, състояща се от Н, арилалкил, алкил и хетероалкил или 1-3 въглеродни атома, и където R99 и R100 Тя може допълнително да се свързва с част, избрана от групата, състояща се от фенил, тиенил, тиазолил, пиридил, нафтил, тионафтил, индолил или наситен алкил, алкокси, моноалкиламино, диалкиламино, тетраалкиламониев, арилалкиламино, ainoalkilaril, карбокси, халоген, хидрокси, амино, амидо амидино, гуанидино, триазолил и сулфонил, и R3 е избран от групата, състояща се от -С (О) - и -С (О) -NR35-СН2-С (О) -.

В допълнение, в съединение A1-A2- (A3)m-B R '1 и R "1 Терминът "алкил" може да съдържа до шест заместителя, включително, например, алкил, и може да бъде свързан с група, като -ОСН2-, -SCH2-, = N-CH2-, = NC (0) -, -СО- или -NY-CO-NZ, където Y и Z могат да бъдат Н, алкил, арилалкил или хетероаралкил. Освен това, R99 и R100 независимо един от друг могат да бъдат заместени със заместител като фенил, тиенил, тиазолил, пиридил, нафтил, тионафтил или индолил, или наситена група, която може да съдържа до пет групи, избрани от алкил, алкокси, моно-, ди- или триалкиламин, тетраалкил амоний, арилалкиламин аминоалкил, карбокси, халоген, хидрокси, амино, амидо, амидино, гуанидино, триазолил или сулфонил.

Предпочитаното съединение със заместители в R2-позиция е съединение, където R100 означава Н и R99 означава или
където W в заместено съединение може да бъде, например, халоген, хидроксилна, амино или амидинова група, и J може да означава, например, О, S или -NR, където R е Н или алкил, арил, или арилалкил.

Съединение от изобретението, което съдържа заместител, заместен при А2 и показващ инхибиторна активност срещу фактор Ха, може например да има заместване при R50, R201 или R202 един или повече хетероатоми, като N, О или S. R202 може също да бъде заместен със заместител, избран от:

когато X е С, N или S, R липсва или може да бъде Н или алкил, който може да бъде заместен с хетероатом и п = 1-5.

Съединението съгласно изобретението, което съдържа смесител при A3 и проявява инхибиторна активност срещу фактор Ха, може да включва, например, заместването на R51 един или повече заместители, такива като Н, алкил, арилалкил или хетероцикъл, евентуално също заместен с хетероатом, като N, О или S.

R210 и R211 може да означава, например, заместителят - (СН2)п-Q, където п е около 1-5 и където Q е амино, амидино, уреа, имидазол, гуанидин, моно-, ди-, три- или тетраалкиламоний на фармацевтично приемлива сол, негов изоуреид или изотиоуреид. В допълнение, R210 или R211 например, алкил, арил или алкиларил. Тези групи могат също да бъдат заместени със заместител, като хидроксил или С1-C4-алкокси.

Съединение от изобретението може да има алтернативно подреждане на заместители, съставляващи фрагмент В. Такова алтернативно подреждане на заместители може да включва, например, заместването R52 азот, кислород или сяра или заместване на R60, R61 или R70 един или повече хетероатоми или алкилови групи.

Общите структури, описани тук, представляват различните съединения от изобретението, които запазват инхибиторната активност срещу фактор Ха, такъв като присъщия YIR трипептид. Описаните тук структури също включват съединения, съдържащи неприродни аминокиселини, аминокиселинни миметици и други органични структури и заместители с подобна функция.

Такива функционални еквиваленти осигуряват подходящи пространствени групировки на желаните заряди и сили, които придават ефективна инхибираща активност срещу фактор Ха.

Специфични примери на съединения от изобретението включват, например,
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac- (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Il-Arg-Leu-N (СН3) О (СН3); Ac-Tyr-2NH)> - Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-пиридил); Ac-Tyr-Ил2NH)> -Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Chg-Arg (NO2) -2NH)> - Leu-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-< Y(COCH2) -Gly-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Dab (Ny-C3Н7N) -Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-PaIMe (3) -NH2; Tyr-Ile-Arg-NH2; D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2, Ac- (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (3-гуанидопропил) Gly-NH2; Cyclo (Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa- (iBu) Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; и Ac-Nal (2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2. Други YIR пептиди съгласно изобретението са показани, например, в Таблици 3 и 5.

Това изобретение се отнася също до съединение със структура А1-А2- (А3).m-В, където R1 средства

R1 избран от групата, състояща се от Н, -СО-Rа, -SO2-Rа, аминозащитна група, 1-6 аминокиселини, които могат да бъдат заместени, и където N-крайната група на споменатите 1-6 аминокиселини е заместена със заместител, избран от групата, включваща Н, -СО-Rа, -SO2-Rа и аминозащитна група; и където Rа избран от групата, включваща алкил, арил и хетероалкил; R ''1 избран от групата, състояща се от Н, ацил и алкил; X е N; R2 означава -chr99-, където r99 избран от групата, включваща алкил, арил, арилалкил, хетероалкил и хетероарил, които могат да бъдат заместени със заместител, избран от групата, състояща се от 1-6 флуорни атоми, хлор, бром, йод, 1-6 амино групи, нитро групи, амидинови групи, амидо групи, карбокси групи, естерни групи, етерни групи и хидроксилни групи; R3 означава -С (О) -; R4 означава -NH-; R5 означава -chr201-, където r201 R3 е алкил; R6 означава -С (О) -; R7 означава -NH-; R8 означава -chr210-; където r210 е хетероалкил, имащ поне един формален положителен заряд, където 1-6 азотни атоми са хетероатом; R9 означава -С (О) -; и В е избран от групата, състояща се от -ORб и -N-RвRг, където rб R е избран от групата, състояща се от Н, алкил и карбокси защитна група, Rв R 'е избран от групата, състояща се от Н и алкил, и Rг избран от групата, състояща се от алкил, хетероалкил и 1-20 аминокиселини, които могат да бъдат заместени със заместител, и където С-крайната група може да бъде модифицирана от карбокси защитна група, от първична амидна група или от част от цикличен пептид като вторична или третична амидна група, образувана с амино групата на радикала R1. Такова съединение може да съдържа една или повече аминозащитни групи.

Например, съединение от изобретението съдържа А1, избран от групата, включваща Tyr, F (pNH2), mAph, pAph и Nal (2), който съдържа 0 или 1 аминозащитни групи; А2 е избран от групата, състояща се от Arg, PalMe (3), Dab (N-С3Н7N), Dap (N-C)3Н7N) и Orn (N-C)3Н7N); и В е избран от групата, състояща се от Н, ОН, NH2, една до пет аминокиселини или техните функционални еквиваленти и карбокси-защитна група. Примери за такива съединения включват Ac-pAph-Chg-PaIMe (3) -NH-CH2-Спх; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PaIMe (3) -NH2; циклопентил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) - NH2; 3qc-pAph-Chg-PaIMe (3) -NH2; 2-фуроил-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 5-Ме-тиенил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; и Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -ol (виж също таблица 5).

Изобретението освен това се отнася до съединение, което има структура А1-А2-В, а именно А1-А2- (А3).m-В, където m = 0.

В такова съединение В може да означава хетероарилалкил, като (4- (N-метилпиридин)) метил; 2- (3- (N-метилпиридин)) метил; 2- (3- (N-метилпиридин)) метил; 2- (3- (N-метилпиридиний) ет-1-ил, 1- (4- (N-метилпиридин)) - ет-1-ил; (n-амидин) бензил, 2- (4- (N-метилпиридиний) )) проп-1-ил и 2- (4- (N-метилпиридин)) ет-1-ил Ac-pAph-Chg-AMP (4) и Ac-pAph-Chg-AEMP (4) са примери за такива съединения.

Изборът на включване на L- или D-аминокиселини в съединението съгласно това изобретение може да зависи отчасти от желаните характеристики на пептида. Например, включването на една или повече D-аминокиселини може да придаде повишена стабилност на съединението in vitro или in vivo. Включването на една или повече D-аминокиселини може също да увеличи или намали фармакологичната активност на съединението. В някои случаи може да е желателно да се позволи на съединението да остане активно само за кратко време.

В такива случаи включването на една или повече L-аминокиселини в съединението може да позволи на ендогенните пептидази в човешкото тяло да асимилират съединението in vivo, като по този начин се ограничава ефекта на активното съединение върху тялото.

Специалистът може да определи желаните желани характеристики на съединенията съгласно изобретението, вземайки предвид например възрастта и общото здраве на пациента.

Съединението от изобретението може да бъде синтезирано като се използва, например, автоматичен синтезатор (виж Пример 1).

Селективна модификация на реактивна група, такава като групата, присъстваща в страничната верига на аминокиселина, или N-крайната или С-крайна реактивна група в пептида, може да даде на съединението желаните характеристики, такива като повишена разтворимост или подобрена инхибираща активност.

Ако се използват твърдофазови синтезни методи, химичният състав на съединението може да бъде манипулиран, когато пептидът се присъедини към смолата или след като пептидът се разцепи от смолата, за да се получи, например, N-краен дериват, такъв като N-терминално ацилирано съединение.

Такива модификации могат също да бъдат извършени с карбоксилната група на съединението, включително С-крайната карбоксилна група, която може да бъде, например, амидирана.

Специалистът може също да синтезира YIR пептид, използвайки метода на синтез в среда на разтворител. Синтезираното съединение може да бъде пречистено като се използват добре познати методи като реверсивна високоефективна течна хроматография (HPLC, виж Пример 1) или други методи за изолиране, базирани например на използването на размер, заряд или хидрофобност на съединението. Добре известни методи като аминокиселинно секвенциониране или масспектрометрия (MS) могат също да бъдат използвани за характеризиране на структурата на съединение от изобретението.

YIR пептидите съгласно изобретението могат да бъдат линейни или циклични (виж например Таблица 3 по-долу). Циклизирането може да се извърши чрез образуване на мост между два несъседни остатъка, фрагменти или заместители, които могат да бъдат във или извън YIR фрагмента.

Циклизирането може също така да се осъществи, например, чрез образуване на мост между един от остатъците в състава на YIR фрагмента и не-съседния остатък, фрагмент и заместител извън YIR последователността.

Например, пептиди или пептидомиметици могат да бъдат циклизирани чрез образуване на S-S, -CH връзки2-S-, -CH2-О-СН-, лактамни или естерни връзки, или по известни методи, описани по-горе (виж Hruby, Life Sci. 31: 189-199 (1982); Toniolo, Int.J.Pept.Prot.Res. 35: 287-300 ( 1990) Kates et al., Tetr.Lett. 34: 1549-1552 (1993)).

Терминът "извън YIR фрагмента" се използва за означаване на не-тирозин, изолевцин или аргининов остатък на YIR последователност или негов еквивалент, както е намерено в YIR пептида от изобретението.

Обратно, изразът "в състава на YIR фрагмента" означава, че включва най-малко един тирозинов остатък, изолевцин и аргинин YIR последователност или негов еквивалент. Терминът "мост" във връзка с циклично съединение означава връзка, образувана между две несъседни аминокиселини, намерени в YIR пептида от изобретението.

Циклизирането може да бъде постигнато чрез образуване, например, на дисулфидна връзка или лактамова връзка между X1 и X2. Остатъците, способни да образуват дисулфидна връзка, включват, например, Cys, Pen, Mpr и Mpp и неговите еквиваленти, съдържащи 2-амино групи.

Остатъци способни да образуват лактамов мост включват, например, Asp, Glu, Lys, Orn, алфа, бета-диаминопропионова киселина, алфа-аминоадипинова киселина, алфа, гама-диаминомаслена киселина, diaminouksusnuyu киселина, аминобензоена киселина и меркаптобензоена киселина. Описаните тук съединения могат да бъдат циклизирани, например, чрез лактамна връзка, която може да използва група в страничната верига на един съседен остатък за образуване на ковалентно свързване към N-крайната амино група X1 или Y. Алтернативни свързващи структури могат също да бъдат използвани за циклизиране на съединения съгласно изобретението, включително, например, пептиди и пептидомиметици, които могат да бъдат циклизирани чрез SS, -CH връзки2-S-, -CH2-О-СН2-, лактам, естер или други връзки (виж, например, Hruby, Supra, 1982; Toniolo, Supra, 1990; Kates et al. Supra, 1993).

Съединението съгласно изобретението може да бъде получено като хомогенно или като смес от съединения, съдържащи различни комбинации от заместители.

Голям избор на заместители ви позволява да регулирате физикохимичните свойства на аналозите на пептидното съединение.

Изборът на заместител също засяга свързващото средство на съединението (виж примерите).

Различни съединения, съдържащи различни места на заместване, показват различни нива на инхибиторна активност срещу фактор Ха. Тези съединения са синтезирани съгласно процедурите, описани в примерите. Извършва се тестване на пептиди за инхибиторна активност, като се използват методите, описани в примери XXXVII и XXXVIII. Използвайки такива методи, специалист може да синтезира съединението, описано тук, включително неговата модификация, и да определи инхибиторната активност срещу фактор Ха.

Изобретението осигурява съединения, които специфично инхибират активността на фактор Ха.

Такива съединения имат Ki от 100 цт, за предпочитане 2 nm по отношение на активността на фактор Ха, и на практика не инхибират активността на други протеази, участващи в коагулацията и фибринолизата (виж таблица 2). Такива други протеази включват, например, тромбин и плазмин. Специфичността на съединенията от изобретението е показана в Пример XXXVII по-долу (виж също Таблица 2).

Съединението от изобретението може да се използва благоприятно като антикоагулант, който може да се свърже с кръвна проба, за да се предотврати коагулацията. Например, ефективно количество от съединение от изобретението може да се свърже с прясно изтеглена кръвна проба, за да се предотврати нейната коагулация. Използваният термин "ефективно количество", използван във връзка със съединенията съгласно изобретението, означава количеството на съединението, което инхибира активността на фактор Ха. Специалистът е наясно, че ефективно количество от съединение от изобретението може да бъде определено като се използват методите, описани тук (виж примери XXXVII и XXXVIII), както и известни методи.

Като се има предвид описаното използване на съединението от изобретението, специалистът в областта на техниката осъзнава, че средство, като хепарин, може да бъде заменено със съединение от изобретението. Такава употреба на съединението съгласно изобретението може да доведе например до намаляване на разходите в сравнение с други антикоагуланти.

В допълнение, съединението от изобретението може да бъде използвано за лечение на различни клинични заболявания, включително, например, лечение на сърдечно-съдови заболявания и усложнения, свързани например с инфекция или хирургична намеса.

Примери за усложнения след операцията включват хроничен и проксимален тромбофлебит, който може да се развие след операция. Така, съединението от изобретението е полезно като лекарство за намаляване или предотвратяване на нежелана кръвосъсирване при пациент.

Тъй като YIR пептидът от изобретението може да инхибира активността на фактор Ха, такова съединение може да бъде подходящо за намаляване или инхибиране на кръвосъсирването при индивид. Както се използва тук, терминът "индивид" означава гръбначно, включително бозайник, такъв като човек, в който факторът Ха участва в каскадна коагулация.

Коагулацията на кръв в индивид може да бъде намалена или предотвратена чрез прилагане на индивида на терапевтично ефективно количество YIR пептид от изобретението. Терминът "терапевтично ефективно количество" се използва за означаване на дозата на YIR пептида, която индивидът трябва да бъде приложен, за да инхибира активността на фактор Ха в индивид. По-специално, терапевтично ефективно количество от съединение от изобретението инхибира каталитичната активност на фактор Ха или директно в протромбиназния комплекс или като разтворимо производно на единицата, или индиректно чрез инхибиране на включването на фактор Ха в протромбиназен комплекс. По-специално, такива съединения могат да инхибират активността на фактор Ха с Ki +): намерено 659.4, изчислено (изчислено) 659.9.

Пример III Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH синтез2
За синтеза на Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2 1 g Rink'a смола (0.6 mmol NH2/ g смола), използвана в метода, описан в пример 1. Полученият пептид се характеризира с: (М + Н) +: намерено 685.4, кал. 685.9.

Пример IV Синтез на Ac- (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
Използва се 1 g смола Rink'a (0.6 mmol NH2/ g смола).

Използвайте общия метод за синтез в твърдата фаза. След като Tyr се освободи и пептидът се измие правилно, се добавя 50 екв. Изобутиралдехид към DMF, съдържащ 2% ледена оцетна киселина. Получената смес се разклаща в продължение на 4 часа при стайна температура. След промиване на пептида с DMF, съдържащ 2% оцетна киселина (2 х 8 ml), се добавя 1 g NaBH.3CN в 10 ml DMF, съдържащ 2% оцетна киселина. Пептидната смола се разклаща в продължение на 30 минути, след това се филтрува и се прибавя нова смес от NaBH.3CN в смес от DMF / оцетна киселина, реакцията продължава още 30 минути

След това пептидната смола се промива със смес от DMF / 2% оцетна киселина (2 х 8 ml) и DMF (2 х 8 ml). Получената моноалкилирана пептидна смола се ацетилира със смес от оцетен анхидрид и триетиламин в DMF (30 eq, 6 h).

След подходящо измиване на пептида, пептидът се разцепва и освобождава, както е описано в Пример I.

Пречистената HPLC на пептида се анализира чрез мас-спектрометрия. (М + Н) +: намерено 758.4, изч. 758.5.

Пример V. Синтез на Tfa- (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
Същата процедура, както е описана в пример IV, се използва за получаване на (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink смола. Крайното трифлуороацетилиране се извършва чрез третиране на пептидната смола с 0.7 М трифлуорооцетен анхидрид в присъствието на диизопропилетиламин (DIEA) и N-метилимидазол (NMI) (1: 3: 0.3 екв.) В продължение на 45 минути.

Разцепването на пептида от смолата и изолирането на пептида се извършва, както е описано в пример IV. Пречистен пептид, идентифициран по метода на MS. (М + Н) +: намерено 812.4, изч. 812.5.

Пример VI Синтез на Ac-Tyr-Ile-Arg-N (СН3) О (СН3).

Синтез на Вос-Arg (Ng-Tos) -N (CH3) О (СН3) извършени в съответствие с метода, описан в литературата (Fehrentz and Castro, Supra, 1983). Вос-Arg (N-Tos) -N (CH3) О (СН3) (200 mg) се смесва с 5 ml трифлуороцетна киселина (TFA) при стайна температура и се разбърква в продължение на 20 минути. Изчезването на изходното съединение се контролира чрез тънкослойна хроматография (TLC) при използване на СНС13 МеОН: СН3СООН (90: 9: 1) и се открива визуално чрез пръскане с нинхидрин и ултравиолетова светлина. Изпаряването на оставащата TFA под вакуум и сушенето във вакуум над КОН гранули води до получаване на твърд материал с подходяща маса. (М + Н) + намерено 371.2, кал. 371.4.

В първата колба, 150 mg от получения по-горе материал се разтварят в 1 ml DMF, след това се добавят 57 μl триетиламин и сместа се охлажда до 0 ° С. Във втората колба се разтварят 171 mg Z-Tyr-Ile-OH (Biochem Bioscience) в безводен тетрахидрофуран (THF). Philadelphia PA) и се охлажда до -10 ° С, след което се добавят 44 μl NNM μl изобутил хлороформат в азотна атмосфера и сместа се разбърква в продължение на 15 минути. Преди това се получава Arg (Tos) N (CH3(ОСНз3) в DMF се добавя към смесения дипептид Z-Tyr-Ile-OH анхидрид и сместа се разбърква при -10 ° С в продължение на 30 минути и след това през нощта при стайна температура.

След третиране на реакционната смес, както е описано в пример 1, пептидът се изсушава под вакуум и малка част се пречиства чрез HPLC и се анализира от MS; пептидът има очакваното молекулно тегло (781). Полученият пептид Z-Tyr-Ile-Arg (Tos) -N (CH3)) OCH3 смесва се с 500 μl анизол и се деблокира с HF по обичайния метод.

След третиране, 169 mg Tyr-Ile-Arg-N (СН3) О (СН3) и се идентифицира с MS метода (намерено 493.6, изчислено 494).

След това остатъчният пептид се разтваря в 1 ml IN HC1 и се лиофилизира.

Tyr-Ile-Arg-N (СН3) OCH3 2HCl (76 mg) се разтваря в ацетонитрил, охлажда се до 0 ° С и се добавят 13 μl пиридин и след това 15 μl оцетен анхидрид. Сместа се разбърква при 0 ° С в продължение на 3 часа и крайът на реакцията се поставя върху нинхидринова проба. След разбъркване при стайна температура в продължение на 8 часа, реакционната смес се обработва и полученият продукт Ac-Tyr-Ile-Arg-N (СН)3) OCH3 анализират се по метода на MS (намерено 535.6, изчислено 535.3).

Пример VII Ac-Tyr-Synthesis< CH2NH)> - Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
а) Синтез на Fmoc-Tyr (But) -H
4.6 g (10.0 mmol) Fmoc-Tyr (But) -OH, 2.1 g (10.1 mmol) дициклохексилкарбодиимид (DCC), 1.26 g (10.1 mmol) бензилмеркаптан и 0.12 g DMAP реагира в дихлорометан, както е описано от Ho и Ngu (J.Org.Chem. 58: 2315 (1993)).

След третиране се изолира Fmoc-Tyr- (But) -S-CH.2C6Н125 и след редукция на тиоетера чрез смесване с триетилсилан в присъствието на 10% Pd върху въглерод и пречистване чрез тънкослойна хроматография, се получава Fmoc-Tyr (But) -Н с добив 81%. NMR данните и добивът на продукта са както се очаква.

б) Синтез на Fmoc-Tyr (But) -< (CH2NH)> - Ile- (O-Allyl)
0.73 g (1.66 mmol) от Fmoc-Tyr (But) -OH и 0.209 g (3.32 mmol) NaBH3КН в 20 ml 1% АсОН в DMF се добавя към разтвор на 0.516 g (1.82 mmol) от TFA Ile- (O-Allyl) в 2 ml DMF. След 2 часа, реакционната смес се обработва и крайният продукт се пречиства чрез хроматография върху тънък слой (етил ацетат: хексан, 35:65), за да се получи масло, характеризиращо се със съответните данни за NMR и MS. (М + Н): намерено 599, кал. 598.7.

в) Синтез на Fmoc-Tyr (But) -< (CH2NH)> Ile-OH
К 0.467 g (0.78 mmol) Fmoc-Tyr (But) -< (CH2NH> -Ile-O-Allyl в 10 ml дихлорометан се добавят 89 μl (1.56 mmol) HOAc, 20 μl триетиламин (IEA) и 0.02 g от PdCl комплекса2(Ph3)2.

Веднага се добавят 231 μl (8.86 nmol) Bu3SnH и сместа се разбърква в продължение на 1 час при стайна температура. След подходяща обработка на реакционната смес, продуктът се пречиства чрез хроматография в тънък слой (СНС1.)3 МеОН: 20: 1) за получаване на пептид с добив 69% (0.319 g). (М + Н +): намерено 559, изч. 558.

Fmoc-Tyr (Но) -< (CH2NH)> Ile-OH след това се свързва със смола Arg (Pmc) -Leu-Pro-Rink, използвайки общ метод за синтез на твърда фаза, както е описано в Пример I. Ac-Tyr (But) - таргетна пептидна смола< (CH3NH)> - Ile-Arg (Pmc) -Leu-Pro-Rink се деблокира и разцепва, както е описано в Пример I и се пречиства чрез HPLC метод върху С18 колона.

Пример VIII. Синтеза на Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-пиридил) а
Оксимната смола (DeGrado и Kaiser, J. Org. Chem. 45: 1295 (1980) (0.862 g, 0.6 mmol / g) е свързана през нощта към Boc-Arg (Tos) -OH в присъствието на DIC / HOBt. промива се с DMF, след това с DCM и се ацетилира с оцетен анхидрид / DIEA (1: 1 екв.) в DCM.

След промиване на смолата с DCM, DMF и DCM, тя се деблокира с 25% TFA в DCM в продължение на 30 минути. Получената смола се промива с DCM, изопропанол и DCM. С TFK. Arg (Tos) -OxmR свързва Boc-Ile-OH в форма на симетричен анхидрид (3 екв.) В присъствието на 1.5 eq DIEA в DCM. Циклите на промиване, ацетилиране и освобождаване, описани по-горе, се повтарят. След освобождаване, добавя се свързване като Ile, Boc-Tyr (2-BrZ) OH, след това се освобождава Boc-Tyr (2-BrZ) -Ile-Arg (Tos) -OxmR пептидна смола и се ацетилира за получаване на Av-Tyr (2-BrZ). ) -Ile-Arg (Tos) -OxmR. Пептидната смола се суши под вакуум, за да се получи наддаване на тегло от 0.216 g.

Към 1/3 от тази смола се добавят 100 μl (800 μm) 4- (диметиламино) пиридин в присъствието на 60 μl ледена оцетна киселина и 120 μl DIEA в 6 ml DCM.

Смолата се разклаща една нощ при стайна температура. След филтруване на разтвора, получената смола се промива с 3 ml DMF и промивните води се смесват с DCM филтрат. След изпаряване на разтворителя, полученият пептид се деблокира с HF / анизол и се обработва, както обикновено, за да се получи целевия пептид. Извършете електроспрей MS. (М + Н) +: намерено 582.3, изч. 582.

Пример IX Ac-Tyr-Ile синтез< (CH2NH)> - Arg-Leu-Pro-NH2
а) Синтез на Boc-Ile-H
Алдехидът е синтезиран от 1 g Boc-Ile-N (Me) OMe, както е описано от Fehrentz и Castro (Supra, 1983). Алдехидът се идентифицира чрез тънкослойна хроматография и ЯМР, както е описано в тази справка.

б) Синтез на Arg (Tos) -Leu-Pro-MBHA
Синтезът на трипептидната смола се провежда в твърдата фаза, както е описано в пример I.

в) Синтез на Boc-Ile-< (CH2NH)> - Arg (Tos) -Leu-Pro-MBHA
Boc-Ile-H е свързан с Arg (Tos) -Leu-Pro-MBMA трипептидна смола чрез редуктивно аминиране при използване на NaBH3CN в DMF, съдържащ 1% оцетна киселина. Вос групата се разцепва както обикновено и Ac-Tyr-OH се свързва, използвайки DICK / HoBt.

Крайната пептидна смола (0.7 g) се деблокира и пептидът се разцепва от смолата, използвайки смес от HF / тиоанизол. 19 g суров Ac-Tyr-Ile-< (CH2NH)> - Arg-Leu-Pro-NH2 пречистен чрез HPLC върху С18 колона, за да се получат около 5 mg> 90% чист мишен пептид. (М + Н +): намерено 688.4, изч. 687.9.

Пример X. Синтез на Ac-Tyr-Ile-Dab (N-С3Н7N) -Leu-Ala-NH2
0.2 g SCAL-TG (0.2 mmol NH2/ g) (Patek and Lebl, Tetr.Lett. 32: 3891-3894 (1991)) са свързани с Fmoc-Ala-OH и Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dab (Вос) -ОН, Fmoc-Ile-OH и Fmoc-Tyr (But) -OH, използвайки методите, описани в пример I.

След ацетилиране на N-крайната група и освобождаване на страничната верига на TFA, промива се Ac-Tyr-Ile-Dab-Leu-Ala-SCAL-TG пептидната смола, неутрализира се и се третира с 0.3 М PyBroP / NMI в DMF в продължение на 2 часа. Полученият пептид се разцепва от смолата като се използва 1М трифенилфосфин / (СН3)3SiCl в DCM (3 х 1 час), след това 100% TFA (1 час). След изолиране на суровия пептид чрез утаяване с диетилов етер, пептидът се лиофилизира от 0.1% воден разтвор на TFA. Ac-Tyr-Ile-Dab пептид (N-С3Н7N) -Leu-Ala-NH2 пречистен чрез HPLC и MS. (М + Н +): намерено 676.4, изч. 676.4.

Пример XI. Ac-Tyr-Ile-PalMe (3) -NH синтез2
С 1.0 g смола Rink (0.48 mmol NH2/ g свързват се Fmoc-Pal (3) -OH, Fmoc-Ile-OH и Fmoc-Tyr (But) -OH като се използват методите, описани в пример I. Към 0.25 g от получената пептидна смола Fmoc-Tyr (But) - Ile-Pal (3) -Ринк добавете 500 мел метил йодид (MI) към DCM и разклатете в продължение на 6 часа. Получената пептидна смола Fmoc-Tyr (But) -Ile-PalMe (3) -Rink се деблокира и ацетилира и разцепва, както е описано в пример I. Част от суровия пептид се пречиства чрез HPLC метод и MS се провеждат.

Пример XII. Синтез на Ac-Cyclo (Glu-Tyr-Ile-Arg-Leu-Lys) -NH2
1 g SCAL-TG (0.29 mmol NH2/ g) (виж Пример X) е свързан с Fmoc-Lys (Вос) -ОН, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pmc) -OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr (But) -OH и Fmoc-Glu (OtBu) -OH, използвайки методите, описани в Пример I.

След отстраняване на Fmoc, пептидната смола се ацетилира и се промива с DMF, след това с DCM. Пептидната смола Ac-Glu (OtBu) -Tyr (But) -Ile-Arg (Pmc) -Leu-Lys (Boc) -SCAL-Tg се освобождава с реагент К, промива се, неутрализира се и се циклизира, използвайки BOP / HOBt / DIEA (5: 5: 5 екв.) В DMF в продължение на 2 часа. Краят на контрола на свързването, използвайки нинхидрин, както е описано от Kaiser (Kaiser et al., Anal. Biochem. 34: 595 (1970)). След циклизиране, пептидът се разцепва от смолата, пречиства се по метода GHUR и MS. (М + Н) +: намерено, 844.5, изч. 844.5.

Пример XIII Циклосинтез (Cly-Tyr-Ile-Arg-Gly)
1 g от оксимната смола (виж пример VIII) (0.6 mmol NH2/ g) се свързва през нощта с Boc-Gly-OH в присъствието на DIC / HOBt. След промиване и деблокиране, смолите комбинират Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ile-OH и Вос-Tyr (2BrZ) -OH, използвайки методите, описани в Пример VIII.

1/3 от пептидната смола, Boc-Tyr- (2BrZ) -le-Arg (Tos) -Gly-Oxime се деблокира и се свързва с Boc-Gly, използвайки DICK / HOBt. Пептидната смола се деблокира, неутрализира се и се циклизира една нощ в DMF, съдържащ 1% оцетна киселина. Смолата се филтрува и промива (DMF), филтратите се смесват и органичният разтворител се отстранява чрез изпаряване под вакуум.

Пептидът се деблокира (HF / анизол), лиофилизира се, пречиства се чрез HPLC метод и се извършва MS. (М + Н) +: намерено 547.8, изч. 547.8.

Пример XIV. Синтез на N-заместени глицинови съединения: синтез на Ac- (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (3-гуанидопропил) Gly-NH2
За синтеза на N-заместени глицини, методът на Zuckermann et al. (J. Am. Chem. Soc. 114: 10646 (1992), reference), 1 g SCAL-TG (0.29 mmol NH)2/ g) (виж пример X) се свързва с бромооцетна киселина чрез симетричен анхидрид в DCM / DMF. Всяка реакция на комбиниране се повтаря два пъти. За Br-CH стъпка2CO-SCAL-TG се добавя Boc-NH-CH2СН2СН2NH2 в DMSO и се разклаща смолата за 2 часа.

След освобождаването, процесът се повтаря, редувайки свързването на Br-CH2СООН с смола и реакцията на смолата, съдържаща бромооцетна киселина и съответния амин.

Смола (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (Вос-NH- (СН2)3Gly-SCAL-TG се ацетилира с оцетен анхидрид / DIEA / NMU (1: 1: 0.25) в DMF за една нощ. След освобождаването на Вос групата, Ac- (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (3-аминопропил) Cly-SCAL-TG смола се обработва с 1,8 М карбоксиамидинпиразол НС1 (Bernatowicz et al., J. Org. Chem. 57: 2497- 2502 (1992)) в присъствието на DIEA (1: 1) в DMF в продължение на 3 часа при стайна температура.

Краят на гуанилацията се определя от разбиването на Кайзер. Разцепването и обработката на получения пептид се извършва, както е описано в пример X, и MS се извършва. (М + Н) +: намерено 502.3, изч. 502.3.

Пример XV. Синтез на дикетопиперазинови съединения: синтез на цикло (Ser-Ida) -Ile-Arg-Leu-Ala-NH2
Първоначалният защитен тетрапептид, Fmoc-Ile-Arg (Pmc) -Leu-Ala-Rink, се получава чрез Fmoc стратегия с Rink смола (виж пример I). След освобождаване на Fmoc, пептидната смола е Fmoc-ida (ОМе) -ОН (3 екв; DICK, HOBt) и Fmoc-Ser (tBu) -OH (7 екв; симетричен анхидрид) са свързани последователно. Крайното освобождаване и спонтанно затваряне на пръстена се извършват едновременно чрез задържане на 50% пиперидин / DMF в продължение на 1 час. След промиване в няколко етапа, крайният пептид се разцепва и освобождава, като се използва смес от TFA / тиоанизол / Н2О (95: 2.5: 2.5).

Полученият пептид се третира както е описано по-горе и се анализира по метода GHUR (> 95%) и метод MS. (М + Н) +: намерено 655.4, изч. 655,38.

Пример XVI. Синтез на Ph-C (NOCH2Ph) -CO-I-R-NH2
0.2 g смола на Rink се свързва с Fmoc-Arg (Pmoc) -OH, Fmoc-Ile-OH, последвано от отстраняване на Fmoc защитата (виж пример I).

С пептидна смола, Ile-Arg (Pmoc) -Rink, свързва Ph-C (NOCH2Ph) -СООН, използвайки DICK / HOBt, както е описано по-горе. Пептидна смола, Ph-C (NOCH2Ph) -CO-Ile-Arg (Pmc) -Rink, се третира както е описано в пример I, и MS се извършва. (М + Н) +: намерено 524.3, изч. 524.6.

Пример XVII. Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH синтез2
Синтезът се провежда със 100 mg смола Rink'a (0.48 mmol / g) съгласно метода, описан в Пример 1, като се използват следните производни на аминокиселини: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg (Pmc) -OH Fmoc-Ile-OH и Fmoc-pAph- (Fmoc) -OH (рацемична смес).

Разцепването и изолирането на пептида се извършва, както е описано в пример I. И двата диастереомерни пептида се изолират чрез хроматография с обърната фаза-HPLC и се идентифицират чрез MS метод. (М + Н) +: намерено 754.4, изч. 754.5.

Пример XVIII. Синтез на Ac-Tyr-Chg-Arg-ol
Пептидната последователност се получава с 0.25 g Fmoc-Arg (Pmc) -Sasrin смола (0.5 mmol NH).2/ g смола; Bachem Bioscience), използвайки метода, описан в Пример I. След освобождаване на N-терминален Fmoc и ацетилиране, защитеният пептид се разцепва от смолата чрез редукционно отстраняване като С-терминален алкохол (Mergler et al. Peptides pp 177-178 (eds. Schneider и Eberle; Leiden 1993), включен чрез препратка). Пептидната смола се разклаща с разтвор на NaBH4 (4 екв.) В 2 мл THF: EtOH (6: 1) в продължение на 24 часа. След реакцията на разцепване, смолата се промива с DCM, след това с разтвор за разцепване и промивките се комбинират и лиофилизират. Лиофилизираният пептид се деблокира чрез третиране с TFA / вода / тиоанизол (90: 5: 5) в продължение на 2 часа и пептидът се анализира посредством MS, чрез утаяване, пречиства се чрез HPLC. (М + Н) +: намерено 505.3, изч. 505.3.

Пример XIX. Ac-Tyr-Chg-Arg-ol, синтез на ацетат
Защитеният пептиден алкохол се получава, както е описано в Пример XVIII.

10 mg от суровия продукт се разтварят в DCM / ACN и се третират с оцетен анхидрид (2 mmol) в присъствието на TEA (2.4 mmol) в продължение на 20 минути. Разтворът се филтрува, изпарява и пептидът се освобождава, както е описано по-горе. Пептидът се пречиства чрез HPLC и се анализира от MS. (М + Н) +: намерено 547.3, изч. 547.3.

Пример XX. Ac-Phe синтез (pNH2) -Chg-Orn (C (NH) CH3-Leu-Pro-NH2
1 g "TENTAGEL'S" NH2 смола (0.28 mmol NH2/ g смола; Rapp Polymer; Tubingen Germany) е функционализиран с SCAL линкер, както е описано в Пример X и следните аминокиселини са свързани: Fmoc-Pro-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Orn- (Вос) -ОН и Fmoc-Chg-OH. Пептидната смола на Fmoc-Chg-Orn (Boc) -Leu-Pro-SCAL-TG се обработва с 50% TFA в DCM (1 промиване за 1 минута, след това 1 промиване за 30 минути), промива се 3 пъти с DCM, неутрализира се с 5% DIEA в DXM (2 х 30 s) и 2 пъти DHM. Към пептидната смола се добавя разтвор на 1.5 g етилимид имидат хидрохлорид (Aldrich) в 4 ml смес от пиридин: DIEA и 3 ml DMF и свързването продължава една нощ при стайна температура.

Пептидна смола, Fmoc-Chg-Orn (C (NH) -CH3-Leu-Pro-SCAL-TG, освобождава се 2% пиперидин в DMF, 4 пъти DCM и се свързва с DIC / HoBt в DMF. Освобождаването на Fmoc и ацетилиране с оцетен анхидрид: пиридин (1: 1) в продължение на 20 минути води до пептидната смола Ac-Phe- (pNH-BOC) -Chg-Orn- (С (NH) CH3) - Leu-Pro-SCAL-TG. Редукцията на SCAL линкер и разцепване на пептид, последвано от HPLC пречистване на суровия продукт, води до очаквания продукт. (М + Н) +: намерено 740.2, изч. 740,48.

Пример XXI. Ac-Phe синтез (pNH2) -Chg-Dap (N-С)6Н11N) -Leu-Pro-NH2
0.5 g SCAL-TG (0.32 mmol NH.)2/ g) се свързва с Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dap (Вос) -ОН и Fmoc-Chg-OH. Вос групата от страничната верига се отстранява при използване на 50% TFA за 20 минути и пептидната смола се неутрализира чрез промиване с 10% DIEA / DCM. Свободната аминогрупа в страничната верига се превръща в диметиламидиева група чрез третиране на пептидната смола с 0.3 М PyBroP / NMI в DMF в продължение на 20 минути. Освобождаването на Fmoc групата със смес от 50% пиперидин / DMF в продължение на 60 минути води до замяната на диметиламидиновата група с пиперидинова група в страничната верига на Dap. Последователността се прекратява чрез свързване с Fmoc-Phe (Вос) -ОН и освобождаване на Fmoc групата. Пептидът се ацетилира и разцепва, както е описано в пример X.

Пептидът, пречистен по метода GHUR, се анализира по метода на MS. (М + Н) +: намерено 752.4, изч. 752.4.

Пример XXII. Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH синтез2
Рацемичният Н-Phe (pCN) -ОН се синтезира по метода, като се използва ацетамидо-балонат (Wagner et al. GDR patent 155954). Рацемичният Ac-pAph-OH се синтезира чрез превръщане на циано групата чрез амонолиза на съответния метилтиоимидат (реакцията на цианогрупата с водороден сулфид) и последващото метилиране на MeI.

1 g смола "ТЕНТАГЕЛ" (заместване = 0.21 mmol NH2/ g смола) и линкерът Knorr (Bernatowicz et al., Tetr. Lett. 30: 4645 (1989)) се използва за пептиден синтез.

Дипептид, Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG, се получава, както е описано в пример I.

3-Пиридилаланинът последователно се метилира с 1 ml MeI в DCM за една нощ. След освобождаване на Fmoc, Ac-pAph-OH се свързва с DIC / HOBt метод и пептидът се третира, както е описано в пример I. (М + Н) +: намерено 550.3, изчислено. 550,31.

Пример XXIII Ac-Tyr-Chg-pAph-Leu-Pro-NH синтез2
Ас-Tyr (But) -Chg-Phe- (pCN) -Leu-Pro-Knorr-TG пентапептиден монтаж се извършва върху 0.4 g "TENTAGEL" (заместване = 0.2 mmol NH2/ г смола), както е описано в пример I. Смолата се третира една нощ в затворена спринцовка с 8 мл смес от пиридин / триетиламин (75:25), наситена с Н2S. Свързан със смола тиоамид се метилира, използвайки 0.5 g MeI в 8 ml ацетон в продължение на 30 минути при 50 ° С, след това се промива с ацетон и метанол.

Метилтиоимид взаимодейства с амониев ацетат в метанол в продължение на 3 часа при 55 ° С, за да се получи желаният продукт, който се разцепва от смолата и се пречиства, както е описано по-горе. (М + Н) +: намерено 761.4, изч. 760,43.

Пример XXIV. Ac-Phe синтез (pCH2NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
Ac-DL-Phe (pCN) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 (суров пептид) се синтезира на g смола Rink (0.6 mmol NH2/ g смола), както е описано в пример I. 125 mg от суровия пептид се разтварят в 50 ml МеОН и се добавя 0,5 ml суспензия Raney Ni (Aldrich). Сместа от пептид и катализатор се хидрогенира при налягане от 35 psi (241.3 kPa) в продължение на 4 часа при стайна температура. Катализаторът се отфилтрува и разтворът се изпарява до сухо. Остатъкът се лиофилизира от 0.1% воден разтвор на TFA, съдържащ 30% АСЕ.

Изсушеният технически продукт се пречиства по метода GHUR и се анализира по метода на MS. (М + Н) +: намерено 741.4, изч. 741.7.

Пример XXV. Синтез на Ac-Phe (рС (NOH) NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
21,1 mg от технически пептид, получен, както е описано в пример XXIV, се смесва с 60.3 mg NH2ОН НС1 (Aldrich) в 1.5 ml МеОН, 0.7 ml пиридин и 0.5 ml чай. Сместа се разбърква в продължение на 72 часа при стайна температура и след това разтворителят и летливите вещества се изпаряват под вакуум. Пептидът се пречиства чрез HPLC и се анализира от MS. (М + Н) +: намерено 770.4, изч. 770.3.

Пример XXVI. Синтез на съединения А1-А2-В
А1-А2-В, т.е. съединения А1-А2- (A3)m-В, където m = 0, се получава, както е показано на ФИГ. 3. Накратко, свързването на рацемичен N-ацетил-4-цианофенилаланин с L-циклохексилглицинов метилов естер (H-Chg-OMe) води до образуването на смес от два диастереомерни дипептида, които са разделени чрез хроматография. Рацемичният n-ацетил-4-цианофенилаланин се разтваря частично в получаването на солта с L-циклохексилглицинов метилов естер. По-малко разтворимата D, L-сол кристализира лесно и следващата комбинация дава суров Ac-F (pCN) -Chg-OMe, който по-нататък се пречиства чрез хроматография върху силикагел. Тези дипептидни естери се хидролизират до съответните киселини като се използва литиев хидроксид в метанол / вода при стайна температура. Двете дипептидни киселини се превръщат в съответните амиди чрез обикновено свързване с подходящи амини RNH2. Амините, които не са търговски продукти, се приготвят по стандартни методи.

Превръщането на цианогрупите в съответните амидини се извършва чрез конвенционални методи или чрез тиоамид и метил тиоимидат, или чрез хидрогениране на съответния амидоксим (пример XXV).

Последният се получава чрез взаимодействие на нитрил с хидроксиламин. Описаните по-долу примери илюстрират получаването на тези съединения чрез тези методи. Съединенията съгласно изобретението могат да бъдат получени чрез други методи; Избраните в примерите методи се използват за удобство.

Пример XXVII. Ac-pAph-Chg-NHCH синтез2-(4-метилпиридин)
Ac-pAph-Chg-NHCH синтез2-(4-метилпиридин) осъществяват превръщането на Ac-F (pCN) -Chg-NH-CH2-(4-пиридил) а, като се използват методите, описани в Пример XXII. Крайният продукт се пречиства по метода GHUR, както е описано в пример I. MS анализ: (М + Н) +: намерено 493.3, изч. 493,29.

Първоначалното вещество се получава, както следва:
а) 2.32 g (10 mmol) Ас- (D, L) -F (pCN) се разтваря в 75 ml етанол при нагряване. Добавя се метилов естер на L-циклохексилглицин (1.75 g, 10 mmol) и сместа се разбърква в продължение на 2 часа при стайна температура. Утаените кристали се филтруват и изсушават, за да се получат 1.55 g от D, L-солта. Филтратът се изпарява частично и се разрежда с етер.

Избраните кристали се събират и изсушават, оставяйки 2.1 g L, L-сол, замърсени с D, L-сол. Суровият L, L-сол се смесва с 20 ml DMF, 0.71 g HOBt и 1.18 g DCC. Сместа се разбърква в продължение на 24 часа при стайна температура. Уреята се филтрира и филтратът се изпарява.

Остатъкът се разтваря в метиленхлорид и разтворът се промива с 1 N НС1 и наситен воден разтвор на натриев бикарбонат. Органичният слой се изсушава и изпарява, остатъкът се хроматографира върху 60 g силикагел, използвайки 20% (v / v) ацетон в метиленхлорид за елуиране. Кристализацията на обединените чисти фракции от метиленхлорид / етер / хексан дава 1.6 g Ac-F (pCN) -Chg-OMe като безцветни кристали с точка на топене (т.т.) от 178-180 ° С.

b) Смес от 1,93 g (5 mmol) от Ac-F (pCN) -Chg-OMe (както в пример XXVII.a по-горе), 100 ml метанол, 10 ml вода и 0,75 g литиев хидроксид хидрат се разбъркват в азотна атмосфера в 24 часа при стайна температура.

Прибавят се 2 ml оцетна киселина, разтворителите се изпаряват и остатъкът се разпределя между метиленхлорид, съдържащ 20% изопропанол и 1 N НС1. Органичният слой се изсушава и изпарява и остатъкът се кристализира от метиленхлорид / етер / хексан, за да се получат 1.6 g Ac-F (pCN) Chg-OH като безцветни кристали с т.т. 216-218 ° С.

c) Смес от 150 mg (0.4 mmol) Ac-F- (pCN) -Chg-OH (виж по-горе), 65 mg (0.6 mmol) от 4-аминометилпиридин, 124 mg (0.6 mmol) DCC, 60 mg (0.44 mmol) HOBt и 5 ml DMF се разбъркват в продължение на 20 часа при стайна температура. Уреята се отстранява чрез филтруване, филтратът се изпарява. Остатъкът се суспендира в метанол и неразтворимият продукт се събира, оставяйки 140 mg безцветен Ac-F- (pCN) -Chg-NHCH.2(4-пиридил) а.

Хроматография върху силикагел с ацетон: метиленхлорид: метанол (4: 5: 1) дава аналитична проба. Кристалното твърдо вещество има т.т. > 250 ° С.

Пример XXVIII. Ac-F (4-амидин) -Chg-NHCH2(4-метилпиридин)
Това съединение се получава чрез взаимодействие на 150 mg Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2(4-пиридил) а (виж по-горе) с водороден сулфид, след това с метил йодид и амониев ацетат.

Продуктът се изолира с HPLC като хомогенно вещество. MS данни: (М + Н) + намерено 493.3, изч. 493,29.

Първоначалното вещество се получава, както следва:
а) Смес от 2,8 g Ac-F (pCN), (L) -циклохексилглицин метилов естер, 940 mg HOBt, 1,57 g DCC и 30 ml DMF се разбърква в продължение на 2 дни при стайна температура. Уреята се отстранява чрез филтруване и филтратът се изпарява. Остатъкът се разтваря в метиленхлорид и се промива с разтвор на 1 N НС1 и 10% воден разтвор на натриев карбонат. Органичната фаза се суши и се изпарява. Кристализацията на остатъка от метиленхлорид / етер / хексан дава 2.05 g безцветен Ac-F (pCN) -Chg-OMe, т.т. 181-183 ° С.

б) Хидролиза на 1,93 g Ac-F (pCN) -Chg-OMe (виж по-горе) с 0,75 g литиев хидроксид монохидрат в 100 ml метанол и 10 ml вода се провеждат, както е описано за L, L-изомер в Пример XXVII по-горе, кристализацията от метиленхлорид / етер дава 1.65 g от Ac-F (pCN) -CHg-OH с т.т. 180-182 ° С.

в) Смес от 225 mg Ac-F (pCN) -Chg-OH (виж по-горе), 100 mg 4-аминометилпиридин, 90 mg HOBt, 180 mg DCC и 6 ml DMF се разбърква през уикенда при стайна температура. Уреята се филтрира и филтратът се изпарява, остатъкът се разбърква с метанол, твърдият остатък се отстранява чрез филтруване, докато остават 190 mg кристален Ac-F (pCN) -Chg-NHCH.2(4-пиридил) и с т.т. > 250 ° С.

Пример XXIX. Ac-pAph SerChg-NH-2СН2 (3-метилпиридин)
Смес от 125 mg Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2СН2(3-Пиридил) а, 2 ml DMSO, 10 ml пиридин и 3 ml триетиламин се насищат със сероводород водород при охлаждане с лед / вода.

След разбъркване в запечатана епруветка една нощ при стайна температура, разтворителите се изпаряват, остатъкът се разтваря в ацетон / етер и се суши, за да се получат 125 mg тиоамид. Този продукт се смесва с 2 ml DMSO, 5 ml ацетон и 0,75 ml метилйодид и сместа се разбърква в затворена епруветка цяла нощ при стайна температура. След разреждане с толуен, разтворителите се изпаряват и остатъкът се разбърква с етер. Етерът се декантира, замества се с пресен етер и разбъркването продължава една нощ, докато каучуковото вещество се втвърди, след това останалият етер се филтрува и остатъкът се суши.

Остатъкът се разтваря в 20 ml метанол и се третира с 0,3 ml оцетна киселина и 0,4 g амониев ацетат.

Сместа се загрява до 55-60 ° С в продължение на 2.5 часа, след това разтворителят се изпарява.

Остатъкът се разтваря в смес от вода / acn / TFA и се лиофилизира. Суровият продукт се пречиства чрез HPLC. MS данни: (М + Н) + намерено 507.3, изч. 507,31.

Първоначалното вещество се получава, както следва. Смес от 150 mg (0.4 mmol) Ac-F (pCN) -Chg-OH, 120 mg (0.6 mmol) 2- (3-пиридил) етиламин хидрохлорид, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0.5 ml диизопропилетиламин и 10 ml DMF се разбъркват в продължение на 24 часа при стайна температура. След изпаряване на разтворителя, остатъкът се разбърква с метанол, неразтворимият продукт се събира чрез филтруване и се промива с метанол и етер, за да се получат безцветни кристали. Филтратът се изпарява и остатъкът се разтваря в метиленхлорид / изопропанол.

Този разтвор се промива с 10% воден разтвор на натриев карбонат, суши се и се изпарява. Остатъкът се хроматографира върху 14 g силикагел, като се използва метиленхлорид: ацетон: метанол (5: 4: 1), за да се получат 40 mg от Ac-F (pCN) -Chg-NHCH.2СН2(3-пиридил) а с т.т. 265-268 ° С.

б) 2- (3-пиридил) етиламин дихидрохлорид се получава, както следва. Смес от 1.3 g 3-пиридилацетонитрил, около 3 g Raney никел и 30 ml метанол, съдържащ 10% об. амоняк, хидрогениран при налягане от 35 psi (241.3 kPa) за 20 часа, използвайки хидрогенатор на Parr. Катализаторът се филтрува през целит и филтратът се изпарява. Остатъкът се разтваря в метиленхлорид, суши се над магнезиев сулфат, филтрува се и се изпарява. Продуктът се превръща в дихидрохлорид като се използва хлороводород в диоксан. Кристализацията от метанол / етер дава 1.4 g безцветни кристали с т.т. 145-148 ° С.

Пример XXX. Ac-pAph SerChg-NH-2СН2(4-метилпиридин)
Това съединение се получава по методите, описани по-горе, чрез взаимодействието на Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2СН2-(4-пиридил) а с сероводород, последвано от метилиране с метил йодид и реакция с амониев ацетат.

Суровият продукт се пречиства чрез HPLC. MS данни: (М + Н) + намерено 507.3, изч. 507,31.

Изходният материал се получава чрез свързване на Ac-F (pCN) -Chq-OH с 2- (4-пиридил) етиламин дихидрохлорид, както е описано в Пример XXIX по-горе.

2- (4-пиридил) етиламин дихидрохлоридът се получава, както е описано в случая на 2- (3-пиридил) етиламин дихидрохлорид (виж по-горе) чрез хидрогениране на пиридил-4-ацетонитрил над Raney никел в присъствието на амоняк. Дихидрохлоридната сол има т.т. 220 ° С.

Пример XXXI. Ac-pAph SerChg-NH-2(4-амидинофенил)
Това съединение се получава при използване на методи, подобни на описаните по-горе за Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2(4-цианофенил) а, чрез третиране с сероводород в DMSO, пиридин и триетиламин. Полученият бис-тиоамид се метилира с метилйодид в смес от DMSO / ацетон, след това се взаимодейства с амониев ацетат, както е описано по-горе. Суровият продукт се пречиства чрез HPLC. MS данни: (М + Н) + намерено 520.3, изч. 520.3.

Първоначалното вещество се получава, както следва. Смес от 75 mg (0.2 mmol) Ac-F (pCN) -Chg-OH, 50 mg (0.3 mmol) от (4-цианофенил) метиламин хидрохлорид, 62 mg DCC, 30 mg HOBt, 0.2 ml DIEA и 2 ml DMF се разбърква в продължение на 24 часа при стайна температура. След филтруване, разтворителят се изпарява и остатъкът се разтваря в метиленхлорид, съдържащ 20% изопропанол. Разтворът се промива с IN HC1 и 10% воден разтвор на натриев карбонат, след това се суши и разтворителят се изпарява.

Остатъкът се разбърква в малко количество метанол / вода, отделената твърда маса се суши, при което се получават 80 mg от Ac-F (pCN) -Chg-NHCH.2(4-цианофенил) а.

(4-Цианофенил) метиламин хидрохлорид се получава, както следва. Смес от 2 g (10 mmol) -бромо-р-толуонитрил, 2 g (10.8 mmol) калиев фталимид и 30 ml DMF се нагрява под обратен хладник в продължение на 1 минута.

След охлаждане, сместа се подкислява с оцетна киселина и се разрежда с вода, за да се предизвика кристализиране на продукта. Кристалите се филтруват, промиват се с вода и се сушат, при което се получават 2.24 g безцветен N- (4-цианофенил) метилфталимид с т.т. 182-184 ° С.

1,5 g N- (4-цианофенил) метилфталимид се суспендира в 50 ml кипящ метанол и се третира с 1 ml хидразин хидрат. След 5 минути се получава бистър разтвор. Метанолът се изпарява и остатъкът се третира с 2N НС1. Суспензията се загрява до кипене и след това се охлажда върху лед. Твърдите вещества се филтруват и филтратът се изпарява. Остатъкът се разтваря във вода. Полученият разтвор отново се нагрява до кипене, охлажда се и се филтрува. Филтратът се алкализира чрез добавяне на натриев хидроксид и се екстрахира с метиленхлорид, съдържащ изопропанол. Органичната фаза се суши, разтворителят се изпарява и остатъкът се превръща в хидрохлорид, кристализира от изопропанол / етер, за да се получат 0,43 g безцветни кристали с т.т. > 260 ° С.

Хидрохлорид (3-цианофенил) метиламин се получава чрез взаимодействие (а-бромо-т-толуолнитрил с калиев фталимид) за получаване на N- (3-цианофенил) метил фталимид с т.т. = 147-148 ° С., както е описано по-горе, позволява да се получи 3-цианофенилметиламин с т.т. 223-226 ° С.

Пример XXXII. Ac-pAph SerChg-NH-2(3-амидинофенил)
Това съединение се получава при използване на описаните по-горе методи. Ac-F (pCN) -Chg-NHCH2(3-цианофенил) се третира със сяра водород в DMSO, пиридин и триетиламин. Полученият бис-тиоамид се метилира с метилйодид в смес от DMSO / ацетон, след това се взаимодейства с амониев ацетат, както е описано по-горе. Суровият продукт се пречиства чрез HPLC. MS данни: (М + Н) + намерено 520.3, изч. 520.3.

Първоначалното вещество се получава, както следва. Смес от 300 mg (0.8 mmol) Ac-F (pCN) -Chg-OH, 200 mg (1.2 mmol) (3-цианофенил) метиламин хидрохлорид, 250 mg DCC, 120 mg HOBt, 0.8 ml DIEA и 10 ml DMF се разбърква в продължение на 24 часа при стайна температура. След филтруване, разтворителят се изпарява и утайката се разтваря в голям обем метиленхлорид, съдържащ 20% изопропанол.

Разтворът се промива с 1 N НС1 и 10% воден разтвор на натриев карбонат, суши се и разтворителят се изпарява. Остатъкът се разбърква с смес от изопропанол / етер, отделената твърда маса се отделя, суши се и се получават 400 mg Ac-F (pCN) -Chg-NHCH.2(3-цианофенил) а.

Пример XXXIII. Ac-pAph-Chg-NHCH (Me) (4-метилпиридин)
Смес от диастереомери на съединението от заглавието се получава чрез взаимодействие на смес от два диастереомера Ac-F (pCN) -Chg-NHCH (Me) (4-пиридил) и водороден сулфид, след това с MeI и амониев ацетат.

Диастереомери разделят HPLC. MS данни: (М + Н) + намерено 507.3, изч. 507,31.

Изходният материал се получава, както следва. Смес от 150 mg (0.4 mmol) Ac-F (pCN) -Chg-OH, 120 mg (0.6 mmol) рацемичен 1- (4-пиридил) етиламин хидрохлорид, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0.5 ml DIEA и 10 ml DMF се разбъркват в продължение на 24 часа при стайна температура. След филтруване, разтворителят се изпарява и остатъкът се разтваря в голям обем метиленхлорид, съдържащ 20% изопропанол.

Разтворът се промива с 10% воден разтвор на натриев карбонат, суши се и се изпарява. Остатъкът се разбърква с смес от изопропанол / етер, отделената твърда маса се събира и суши, при което се получават 125 mg Ac-F (pCN) -Chg-NHCH (Me) (4-пиридил) а като смес от два диастереомера.

Рацемичен 1- (4-пиридил) етиламин хидрохлорид се получава както следва.

Смес от 1 g 4-ацетилпиридин-N-оксид, 2 g Raney никел и 30 ml метанол, съдържащ 20% амоняк (v / v) се хидрогенира в продължение на 24 часа при налягане 30 psi (206.8 kPa).

Катализаторът се отстранява чрез филтруване през целит и филтратът се изпарява.

Остатъкът се разтваря в метиленхлорид, разтворът се филтрува и изпарява.

Остатъкът се разтваря в изопропанол и се третира с хлороводород в етер. Утаените кристали се събират и изсушават, при което се получават 0.9 g продукт с т.т. 198-200 ° С.

Пример XXXIV. Синтез на DIPA (m) pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
а) Синтез на N, N-диизопропиламид (р-цианбензил) малонова киселина (DIPA (m) Phe (pCN)) -OH
Синтеза на 2- (р-цианбензил) малонова киселина се извършва съгласно модифициран метод (виж Pinori et al., US патент N 506191). Към разтвор на 3,8 g 2,2-диметил-1,3-диоксан-4,6-дион (киселина на Meldrum; Aldrich) и 1.12 g NaCNBH3 (Aldrich) в 25 ml DMF се добавят 2,3 g р-цианбензалдехид (Aldrich) и сместа се разбърква в продължение на 2 часа при стайна температура. Към реакционната смес се прибавят 400 ml вода и разтворът се охлажда в ледена баня, рН се довежда до 3,8-4 чрез добавяне на капки 20% воден разтвор на НС1. Бяла утайка се събира в стъклена фуния на Бюхнер и се промива със студена вода. Утайката се суши под вакуум над СаС12 в рамките на 24 часа Тези NMR твърди вещества в CDCI3 показват присъствието на 2,2-диметил-5- (р-циан) бензил-1,3-диоксан-4,6-дион (DCCD) с т.т. 135-142 ° С и Rt 0.45 (CHCI3 МеОН: оцетна киселина; 95: 4: 1).

Към 1,5 ml диизопропиламин в 45 ml DCM се добавят 3 ml N, O-бис (триметилсилил) ацетамид (BSA) и разтворът се загрява под обратен хладник в реакционна колба, снабдена с магнитна бъркалка и кондензатор, съдържащ тръба с CaCl.2, в рамките на 7 часа След охлаждане на разтвора до стайна температура, се прибавят 0,8 g DBPD и реакционната смес се загрява под обратен хладник в продължение на 3 часа (до завършване на превръщането в желания продукт, което е показано с TLC). След охлаждане на реакционната смес, внимателно се добавят 5-8 ml 20% воден разтвор на солна киселина. След разделяне на слоевете, органичният слой се промива с вода, суши се (MgS04)4) и се изпарява до сухо, за да се получи чист продукт, който се използва в следващия етап без допълнително пречистване.

Съединенията се идентифицират чрез NMR в CDCI3 и МС.

b) Синтез на DIPA (m) pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
Пептидна смола DIPA (m) Phe (pCN) -Chg-Arg (PMc) -Leu-Pro-Rink се синтезира по метода, описан в пример I. Получената смола се обработва с хидроксиламин хидрохлорид, както е описано в пример I. Получената смола се обработва с хидроксиламин хидрохлорид, като описано в пример XXV за получаване на DIPA (m) Phe (рС (NOH) NH2) -Chg-Arg (PMC) -Leu-Pro-Rink. След като пептидът се отцепи от смолата и се лиофилизира, суровият продукт (120 mg) се разтваря в 80 ml МеОН и 10 ml наситен разтвор на МН3 в МеОН. 0.25 ml Raney никелова суспензия (Aldrich) се добавя към реакционната смес и сместа се хидрогенира за 24 часа под налягане от 45 psi (310.2 kPa). Катализаторът се отфилтрува, разтворителят се изпарява до сухо и остатъкът се лиофилизира от 1: 1 воден разтвор на 0.1% TFA и ACN. Суровият пептид се пречиства по метода GHUR и се идентифицира връзката MS. (М + Н) + намерено 824.2, изч. 824.5.

Пример XXXV
Съединения с много заместители са доказали, че са ефективни инхибитори на фактор Ха:
Връзка - изчислена. (Получено)
Ac- (2-CF3Bzl) -Y-I-R-L-P-NH2 - 860,5 (860,3)
Ac- (СН3СН2СН2СН (СН3) CH2) -Y-I-r-L-P-NH2 - 786,5 (786,5)
СН3OCO-Y-I-R-L-P-NH2 - 742,4 (742,4)
Ac-Y-Chg-R-NH2 - 518,2 (518,2)
Nal (2) -Cha-R-D (О-алил) -NH2 - 679,4 (679,4)
у-TLE-R-Nle-Р-NH2 - 660,4 (660,4)
Phe (pF) -I-R-L-P-NH-662.3 (662.3)
Ac- (D) Tic (OH) -I-R-L-P-NH2 - 714,4 (714,4)
Ac-Phe (pCN) -I-R-L-P-NH2 - 711.4 (711.4)
Ac-Phe (pCONH2А) -Chg-r-L-P-NH2 - 755,4 (755,4)
у-Chg-R-NH2 - 476.2 (476.2)
Ac-W-Chg-R-L-P-NH2 - 751,3 (751,3)
Ac-Y-I-R-NH-CH (СН3) - (CH2)2-СН3 - 562,3 (562,3)
Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH2 - 722.2 (722.2)
Ac-Y-Chg-R-Ина-NH2 - 629,4 (629,4)
Ac-TZA-Chg-R-NH2 - 509,3 (509,3)
Ac-Y-Chg-R-Pip-NH2 - 629,4 (629,4)
Ac-Phe (pNH2) -Chg-R-NH2 - 517,2 (517,2)
Ac- (Bzl) G- (Chx) Gly- (3-гуанидинопропил) G-NH2 - 502,3 (502,3)
Ac-Y-Chg-R-ol.acetate - 547.3 (547.3)
Ac-Y-Chg-R-ОСН3 - 533,3 (533,3)
Ac-Y-Chg-R-OH-519.3 (519.3)
Bz-Y-Chg-R-NH2 - 532,2 (532,2)
Пример XXXVI. Комбинации от химически промени, които подобряват активността, когато индивидуалните промени може да не подобрят активността.

Измерва се активността на инхибиращия фактор Ха. Обаче, всяко съответно измерване на биологичната активност, като например ефекта на YIR на пептида от изобретението върху коагулационния процес, in vivo активността, in vivo полуживота, оралната бионаличност, оралната достъпност или времето на полуразпад, може да служи като мярка за активността на пептида от изобретението.

Описани са много специфични промени. Като пример се правят две промени, за да се покаже, че се постига по-нататъшно повишаване на активността с комбинация от промени, дори когато отделните промени леко увеличават активността.

Единични химични промени водят до Ac-Y-I-R-L-P с Ki = 0.49 цМ и (iBu) Y-I-R-L-P с Ki = 2.6 цМ в ​​сравнение с изходното съединение Y-I-R-L-P (Ki = 5.3 цМ). Комбинацията от тези две промени води до Ac- (iBu) Y-l-R-L-P-NH2 с Ki = 0.04 цМ. Така, тези резултати показват, че пептидът съгласно изобретението с комбинация от две химични промени може да има значително повишена инхибираща активност срещу фактор Ха в сравнение със съответните аналози с единични промени, дори когато едно основно съединение, като (iBu) Y-I-R-L-P-NH2 няма значително повишена активност в сравнение с изходното съединение Y-I-R-L-P-NH2.

Таблица 3 показва примери на специфични химични модификации, които осигуряват съединения с Ki стойности между 100 цМ и 1 рМ във връзка с инхибиране на фактор Ха.

Пример XXXVII. Инхибиране in vitro на избрани пречистени коагулационни ензими и други серинови протеази.

Способността на съединение от изобретението да инхибира фактор Ха, тромбин, плазмин, еластаза и трипсин се оценява чрез определяне на концентрацията на YIR пептид, което води до инхибиране на ензимната активност с 50% (IR50). Пречистените ензими се използват в хромогенни методи. За да се определи константата на инхибиране, регулирайте стойността на IR.50 за сравнение с субстрата, като се използва формулата:
Kаз = IR50 (1 /<1 + ((концентрация субстрата))/Km (Chen and Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3018 (1973)).

а. Опитът с фактор Ха
За този метод, TBS-P буфер (50 тМ Tris-CI, рН 7.8, 200 тМ NaCl, 0.05% (w / v) NaN3). IR50 определя се чрез комбиниране на 25 μl от човешкия фактор Ха (Enzyme Research Laboratories, Inc.; South Bend, IN) в TBS-P в подходящите ямки на Costar микротитърна плака; 40 μl 10% (v / v) DMSO в TBS-P (неинхибирани контролни проби или различни концентрации на тествания пептид, разреден в 10% (v / v) DMSO в TBS-P и субстрат S-2765 (Na-бензил-оксикарбонил) -D-Arg-Cly-L-Arg-p-нитроанимид), Kabi Pharmacia, Inc, Franklin, OH) в TBS-P.

Определянето се извършва чрез прекультивиране на пептидния инхибитор плюс ензим в продължение на 10 минути, след което експериментът започва с добавяне на субстрат за получаване на краен обем от 100 μl. Скоростта на началната хидролиза на хромогенния субстрат се определя от промяната в абсорбцията при 405 nI, като се използва кинетичен четец на плочи Bio-tek Instruments (Ceres UV900HDi) при 25 ° С в линейната част от времето (обикновено 1-5 минути след добавяне на субстрата). Концентрацията на инхибитора, която причинява 50% намаляване на скоростта на хидролиза на субстрата, се определя чрез линейна регресия след изграждане на зависимостта на относителните скорости на хидролиза (в сравнение с неинхибираните контролни проби) върху log концентрацията на пептида. Концентрацията на ензима е 0.5 пМ, а концентрацията на субстрата е 140 цМ.

б) Опит с тромбин
За този метод се използва TBS-P буфер. IR50 както е описано в пример XXXVII. а, с изключение на това, че субстратът е S-2366 (L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-р-нитроанимид; Kabi) и ензимът е човешки тромбин (Enzyme Research Laboratories, Inc; South Bend.IN). Концентрацията на ензима е 1 пМ, а концентрацията на субстрата е 175 цМ.

в) Опит с плазмин
За този метод се използва TBS-P буфер. IR50 определено както в пример XXXVII. a, но S-2251 ((D) -Val-L-Leu-L-Ls-p-nitroanimide; Kabi) се използва като субстрат и човешки плазмин (Kabi) се използва като ензим. Концентрацията на ензима е 5 пМ, а концентрацията на субстрата е 300 цМ.

г) Опит с трипсин
За този експеримент се използва TBS-P, съдържащ 10 тМ CaCl2. IR50 както е описано в Пример XXXVII.а, но субстратът е BAPNA (бензоил-L-Arg-р-нитроанимид; Sigma Chemical Co.; St. Louis, Mo; и ензимът е говежди панкреатичен трипсин (тип XIII, третиран с TRSC; Sigma) Концентрацията на ензима е 50 пМ, а концентрацията на субстрата е 300 цМ.

г) Опит с еластаза
Tris-Cl рН 7.4, 300 тМ, 300 тМ NaCl, 2% (v / v) N-метилпиролидон, 0.01% (w / v) NaN се използва за този тест.3.

IR50 определено както е описано в пример XXXVII.a, но субстратът е сукцинил-Ala-Ala-p-нитроанимид (Calbiochem-Nova Biochem Corp.; San Diego CA), а ензимът е човешка неутрофилна еластаза (Athens GA). Концентрацията на ензима е 75 пМ, концентрацията на субстрата е 600 μm.

Стойността Ki за тестваните съединения е сравнена с контролното съединение TENSTOP (N-алфа-тозил-Cly-р-амидинофенилаланин метил етер; American Diagnostica, Inc., Greenwich CT), което е обратим инхибитор на фактор Ха (Sturzebecher et al., Thromb. Res. 54: 245-252 (1989); Hauptmann et al., Thromb Haerm. 63: 220-223 (1990)) са показани в Таблица 2. Данните показват, че YIR пептидите от изобретението могат да инхибират активността на фактор Ха, но на практика не инхибира активността на други серинови протеази, включително тромбин и плазмин, които участват в процеса на кръвосъсирването и фибринолизата.

Пример XXXVIII. Опит в определянето на инхибиране на коагулацията.

Съединенията от изобретението се оценяват за тяхната способност да инхибират активността на фактор Ха. Ефикасността на различни съединения се оценява чрез протромбиново време (РТ) in vitro като се използва плазмена група донори.

Използва се също така ех vivo опит, при който плазмата се събира в различно време след интравенозно (cv) прилагане на съединение на плъхове или зайци или интрадуоденално приложение на плъхове и, използвайки дефиницията на PV, определя полуживота на плазмата, за да се получи удължено и t лесно възпроизводима крайна точка на коагулация, която се нарича "определяне на РА за разреждане", както е описано по-долу. Ефикасността на различни съединения също се определя, като се използва in vivo модел на тромб при плъхове.

а) Определяне на in vitro времето на разредения протромбин
Към фиброметричното блюдо се прибавят 10 μl топла (37 ° С) група бедна на тромбоцити група човешка кръвна плазма (BTP). (Baxter Diagnostics, Inc.; McGaw Park Il).

Добавят се 50 μl от изпитваното съединение в различни концентрации в TBS-BSA с калций (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 0.1% (w / v) говежди серумен албумин, 20 mM CaCl.2). В контролните експерименти, TBS-BSA се добавя с калций, но без тестваното съединение, за измерване на времето на неинхибирана коагулация.

150 μl от разредения затоплен заек тромбопластин се добавят към чашата на фиброметъра и започва фиброметричния таймер. Преди тестването на съединението се получава крива на разреждане на тромбопластин от заека и се използва за избор на степента на разреждане на тромбопластина, която дава PV приблизително 30 s за неинхибирани контролни проби. Тестова концентрация, осигуряваща 50% инхибиране на коагулацията (IR50) изпитваното съединение (виж таблица 4) се изчислява от времевите параметри на кривата на разреждане.

Алтернативно, разреденото протромбиново време се определя с помощта на "изследователски метод" на автоматичен инструмент ACL3000-plus, Instrumentation Laboratories (IL; Милано, Италия). Тромбопластин се разрежда до достигане на време на съсирване от 30-35 s. Това време на коагулация се приема като 100%. Изградете стандартна калибровъчна крива чрез серийно двукратно разреждане на разредения тромбопластин. (Тромбопластин IL-група на мозъка на зайци). По време на изпитването, проба, 50 μl (плазмата се отделя чрез центрофугиране) се смесва със 100 μl тромбопластин и нефелометричните показания се вземат след 169 s. Времето на коагулация се определя от максималната скорост на промяна на разсейването на светлината, изчислена върху инструмента.

Инхибирането се изразява като активност в проценти, определена чрез сравняване с калибрационна крива.

b) Ех vivo определяне на времето на разредения протромбин
Изпитваното съединение се прилага интравенозно или през опашната вена (плъх) или ушна вена (заек) съгласно одобрен метод.

Кръвни проби от 1 ml се вземат в измерени интервали след прилагане на изпитваното съединение от канюлирана сънна артерия (плъх) или ушна артерия (заек). След центрофугиране за получаване на BTP, плазмата веднага се поставя върху лед за съхранение или замразяване.

За да се определи разреденото протромбиново време, плазмата се нагрява и анализира както по-горе.

Процентът на инхибиране се изчислява от кривата на разреждане на тромбопластина, която се конструира за всяка серия от проби и се използва за определяне на времето, в което приблизително 50% от първоначалната антикоагулантна активност остава в плазмата (Т 1/2). Резултатите от този експеримент показват, че YIR пептидите от изобретението могат да инхибират кръвосъсирването in vitro и след администриране in vivo (виж Таблица 4).

Различни съединения също са тествани за антикоагулантна активност, използвайки ех vivo определяне на времето на разредения протромбин, използвайки интравенозно болусно администриране на различни дози за плъхове.

Всички съединения, изброени в Таблица 5, показват най-малко 30% инхибиране 10 минути след прилагане - С3Н7N) -L-P-NH2
30. Ac-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2
31. Ас-Nal (2) -Chg-R-L-P-NH2
32. Ac-pAph-Chg-Dab (Ny-C3Н7N)
33. Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2
34. Ac-pAph-Chg-PaiMe (3) -L-P-NH2
35. Ac-pAph-Chg-R-NH2
36. Ac-pAph-Chg-R-OH
37. Ac-pAph-Chg-R-NH-Nip-NH2
38. Ac-K-Nal (2) -Chg-R-Hyp-E-NH2
39. DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NH2
40. DIPA-mF (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2
41. Isn-F (pNH2-Chg-R-L-NH2
42. Pza-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2
43. Tfa- (iBu) F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2
44. Tfa- (iBu) Y-Chg-R-L-P-NH2
45. Tfa- (iBu) Y-I-Orn (N-С3Н7N) -L-P-NH2
В някои експерименти, изследваните съединения се прилагат интрадуоде-нално на плъхове. Мъжки плъхове Spraque-Dawley се анестезират с кетамин / ксилазин, прилагани подкожно. Десната сънна артерия е канюлирана за вземане на кръвни проби. Лапаротомията и канюлата на дванадесетопръстника се изпълняват с игла с сферичен накрайник и се притискат, за да се осигури периферното разположение на шева по отношение на точката на вмъкване. Допълнително опъване се поставя в близост до мястото на въвеждане, за да се предотврати изтичане на съдържанието на стомаха. Ефективността на шева за предотвратяване достигането на съединението до мястото на инжектиране се изпитва чрез прилагане на налягане в края на всеки експеримент.

Точката за инжектиране е разположена на около 4 см от кръстосано на дванадесетопръстника и стомаха. Съединенията се прилагат в 1 ml физиологичен разтвор. Кръвна проба от 0,7 ml се взема преди прилагането на тестваното съединение и 15, 30, 60, 90 и 120 минути след приложението. Плазмата се отделя чрез центрофугиране и се анализира за инхибиране на коагулацията, използвайки метода на разреденото протромбиново време.

Следните съединения проявяват най-малко 30% инхибиране при определяне на времето на разредения протромбин, последвано от интрадуоденално приложение на 50 mg / kg от съединението: Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-CHz-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; Ac-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; Ac-Aph-Chg-AMP (4); Циклопентил-СО-pAph-Chg-PaIMe (3) -NH2; 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 2-фуроил-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 5-Ме-тиенил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2, Ac-Y (3-I) -Chg-R-L-P-NH2, Ac-F (pNH2) -CHg-R-ol и Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -ol.

в) Модел на артериовенозна анастомоза на тромбоза при плъхове
Антитромбозната ефикасност на различни съединения от изобретението се оценява като се използва екстракорпорално артериовенозно (AV) шунтиране.

Контурът на AV шунтиране (анастомоза) се състои от тръба с дължина 20 cm, направена от полиетилен (PE) 60, вмъкната в дясната каротидна артерия, тръба с дължина 6 cm, изработена от PE160, съдържаща нишка от мерсеризиран памук с дължина 6,5 cm (5 cm дължина от сегмента) кръв) и втора тръба с РЕ60 с дължина 20 cm, завършваща контура в лявата югуларна вена.

Цялата верига се пълни с физиологичен разтвор преди въвеждането на съединенията.

Изпитваните съединения се прилагат чрез непрекъсната инфузия в опашната вена с помощта на бутална помпа и катетър (обем на инфузията 1,02 ml / час). Съединението се прилага в продължение на 30 минути, след което шънтът се отваря и кръвта се оставя да тече в продължение на 15 минути (общо 45 минути инфузия). В края на 15-минутния период шънтът се затяга, нишката се отстранява внимателно и се претегля на аналитичен вез.

Процентът на инхибиране на образуването на тромб се определя от теглото на тромба, образуван в контролни плъхове, които се инфузират с физиологичен разтвор.

Следните съединения инхибират растежа на тромба най-малко с 30% след инфузия от 33 ug / kg / min: Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-CH2-квадратче за отметка; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-Chx; Bzf-pAph-Chg-PaIMe (3) -NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; Ac-pAph-Chg-AMP (4); Циклопентил-СО-pAph-Chg-PaIMe (3) -NH2; 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 2-фуроил-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; 5-Ме-тиенил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -ол и Tos-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2.

Въпреки че изобретението е разкрито с описание на различни варианти, на специалистите в областта ще бъде ясно, че подробните конкретни примери илюстрират само изобретението. Трябва да се има предвид, че без да се излиза от обхвата на изобретението, могат да бъдат направени различни промени.

Съответно, изобретението е ограничено само от следните претенции.

1. Съединение с неестествен произход, специфично инхибиращо активността на фактор Ха, имащо общата формула
A1-A2- (A3)m-Б,
където m = 0 или 1;
A1 - R1-R2-R3;
А2 - R4-R5-R6;
A3 - R7-R8-R9;
R1 избран от групата, състояща се от

където X е N и R '1 и R "1 независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, ацил, арил, арилалкил и амино-защитни групи,
R2 - CR99R100, където r99 и R100, независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил и хетероарил;
R3 - -С (О) - или -СН2-;
R4 - -NR50-, където r50 означава Н;
R5 - CR201R202, където r201 и R202 независимо избран от групата, състояща се от Н, алкил, арил и арилалкил;
R6 - -С (О) или -СН2-;
R7 - -NR51, където r51 - Н;
R6 - -CR210, R211-, където r210, R211, независимо избрани от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил и хетероцикъл, и алкил, алкиларил и хетероцикъл могат да бъдат заместени с Q или - (СН2)n-Q, където п = 1-5 и Q е избран от групата, състояща се от аминни, амидинови, имидазолови и гуанидинови групи, които могат да бъдат заместени, и моно-, ди-, три- или тетраалкиламониеви фармацевтично приемливи соли, неговия изоуреид или изотиогуреид;
R9 - -С (О) - или -СН2-;
В - -NHR52, където r52избран от групата, включваща Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил, хетероарил, една аминокиселина или две аминокиселини,
или негова фармацевтично приемлива сол, амид, естер, алкохол или алдехид.

2. Съединение съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че m = 1.

3. Съединение съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че m = 0.

4. Съединение съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че В - NHR52, където r52 е избран от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил, хетероарил, една или две аминокиселини.

5. Съединение съгласно претенция 3, където R52 R1 е избран от групата, състояща се от Н, алкил и хетероарил.

6. Съединение съгласно претенция 4 или 5, характеризиращо се с това, че R '1 Понятието "R" е избрано от групата, състояща се от Н, алкил, ацил, арил, арилалкил и амино-защитни групи.

7. Съединение, съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R ''.1 - H.

8. Съединение, съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R ''.1 - алкил.

9. Съединение съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R "1 - ацил.

10. Съединение, съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R ''.1 - арил.

11. Съединение съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R ''.1 - арилалкил.

12. Съединение, съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R ' t1 - група, защитаваща амино групата.

13. Съединение съгласно претенция 6, където R99 Избран от групата, състояща се от Н, алкил, арилалкил, хетероарилалкил и хетероарил.

14. Съединение съгласно претенция 8, където R100 - арилалкил.

15. Съединението от претенция 8, където R100 - хетероарилалкил.

16. Съединение съгласно претенция 6, където R201 - Н или алкил.

17. Съединение съгласно претенция 9, характеризиращо се с това, че R202 - алкил.

18. Съединение съгласно претенция 6, характеризиращо се с това, че R210 - Н или арилалкил.

19. Съединение съгласно претенция 10, където R211 - H.

20. Съединение съгласно претенция 10, където R211 - арилалкил.

21. Съединение съгласно претенция 10, където R211 - хетероцикъл.

22. Съединението с неестествен произход, избрано от групата включително
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-CH2-квадратче за отметка;
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-2CMT;
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-Chx;
Ac-F (pNH2) -Chg-Dab (N-С)3NH7) -L-P-NH2(SEQ ID NO: 263);
Bz-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2(SEQ ID NO: 264);
Tos-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2(SEQ ID NO: 265);
Ac-Y (3-1) -CHg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 266);
у-Chg-R-L-NH2;
Ac-F (pNH2) -CHg-R-ol;
Циклопентил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
3-Igc-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
Bzf-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
3-Igc-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2;
Ac-F (pNH2-Chg-R-NH-2-тиазолил;
2-фуроил-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
5-Ме-2-тиенил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
Ac-Nal (2) -Chg-R-NH-2-тиазолил;
2-Bzf-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2;
Ac-pAph-Chg-Dab (N-С)3Н7N) -L-P-NH2(SEQ ID NO: 268);
Ac- (iBu) pAph-Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 271);
Ac-pAph-Chg-R-Gla-Р-NH2(SEQ ID NO: 272);
Ac-pAph-Chg-R-Pen (СН2COOH) -P-NH2(SEQ ID NO: 273);
Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 274);
Ac-F (pNH2А) -Chg-R- (Me) L-P-NH2(SEQ ID NO: 275);
Ac-F (pNH2) -Chg-R-OEt;
Ac-F (pNH2) -Chg-Orn (N-С)3Н7N) -L-P-NH2(SEQ ID NO: 276);
Ac-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2(SEQ ID NO: 277);
Ac-Nal (2) -Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 278);
Ac-pAph-Chg-Dab (N-С)3Н7N) -NH2;
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -L-P-NH2(SEQ ID NO: 279);
Ac-pAph-Chg-R-NH2;
Ac-pAph-Chg-R-OH;
Ac-pAph-Chg-R-ол;
DIPA- (m) pAph-Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 36);
DIPA- (m) F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2(SEQ ID NO: 289);
Isn-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2(SEQ ID NO: 282);
Pza-F (pNH2А) -Chg-r-L-P-NH2(SEQ ID NO: 283);
Tfa- (iBu) Y-Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 285);
Tfa- (iBu) Y-1-Orn (N-С)3Н7N) -L-P-NH2(SEQ ID NO: 286);
CF3С (О) - (iBu) Phe (NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
Ac-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2;
CF3C (0) - (iBu) Nal (2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
Ac-Phe- (31,4NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
CF3C (0) -Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
(5-бунзимидазоил) -Phe (NH2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
CF3С (О) - (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2;
AC- (Chx-CH2) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2;
D-Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
Ac-Trp-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2;
23. Съединението с неестествен произход, избрано от групата включително
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH-CH2-квадратче за отметка;
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
Brf-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -L-P-NH2(SEQ ID NO: 279);
Ac-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
Циклопентил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
3-Igc-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
2-фуроил-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2;
5-Ме-тиенил-СО-pAph-Chg-PalMe (3) -NH2; и
Ac-pAph-Chg-PalMe (4) -ол.

24. Неприродно съединение, избрано от групата, състояща се от AC-pAph-Chg-AMP (4) и AC-pAph-Chg-AEMP (4).

25. Съединението с неестествен произход, избрано от групата включително
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2(SEQ ID NO: 2);
Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-NH2(SEQ ID NO: 3);
Ac- (iBu) Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2(SEQ ID NO: 4);
Ac-Tyr-Ile-Arg-N (СН3) О (СН3);
Ac-Tyr-< (CH2NH)> Ile-Arg-Leu-Pro-NH2(SEQ ID NO: 5);
AC-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-пиридил);
Ac-Tyr-Ил< (CH2NH)> - Arg-Leu-Pro-NH2(SEQ ID NO: 6);
Ac-Tyr-Chg-Arg (NO2) -< (CH2NH)> - Leu-NH2(SEQ ID NO: 7);
Ac-Tyr-Ile-Arg-< (COCH2) - Gly-Pro-NH2(SEQ ID NO: 8);
Ac-Tyr-Ile-Dab (N-С)3Н7N) Leu-Ala-NH2(SEQ ID NO: 9);
Ac-Tyr-Ile-PalMe (3) -NH2;
Tyr-Ile-Arg-NH2;
D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2;
Ac- (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (3-гуанидопропил) Gly-NH2;
Cyclo (Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly) (SEQ ID NO: 10);
Tfa- (iBu) Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2(SEQ ID NO: 11);
Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2(SEQ ID NO: 12);
Ac-Nal (2) -Chg-Arg-Leu-Pro-NH2(SEQ ID NO: 13);
Ac-pAph SerChg-Златна палма-NH2.

26. Съединението с неестествен произход, избрано от групата включително
Ac-Y-I-R-L-A-NH2(SEQ ID NO: 290);
Ac-Y-I-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 149);
Ac- (iBu) -Y-I-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 94);
Ac-Y-I-R-N- (СН3) О (СН3);
Ac-Y-< (CH2NH)> I-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 135);
AC-Y-I-R-NH-CH2(4-пиридил);
Ac-Y-I-< (CH2NH)> R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 141);
Ac-Y-Ghg-R (NO2)< (CH2NH)> L-NH2(SEQ ID NO: 131);
Ac-Y-I-R-< (COCH2)> - G-P-NH2(SEQ ID NO: 136);
Ac-Y-I-Dab (N-С)3Н7N) -L-A-NH2(SEQ ID NO: 137);
Ac-Y-I-PalMe (3) -NH2;
Y-I-R-NH2;
D-Y-I-R-L-P-NH2;
Ac- (Bzl) Gly- (Chx) Gly- (3-гуанидопропил) Gly-NH2;
Цикло (G-Y-I-R-G) (SEQ ID N0: 183);
Tfa- (iBu) Y-Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 221);
Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 122) и
Ac-Nal (2) -Chg-R-L-P-NH2(SEQ ID NO: 119).

27. Метод за специфично инхибираща активност на фактор Ха, включващ фактор за контакт Xa със съединение съгласно претенция 1.

28. Метод за инхибиране на кръвосъсирването при индивид, включващ прилагане на съединение съгласно претенция 1 към споменатия индивид.